1. Frumskilningur

Á þessu stigi þurfum við að skilja nokkur hugtök og hugtök, til að forðast að gera mistök fyrir framan eldri okkar, eins og:

Sp.: Hver er munurinn á RT-PCR, qPCR, rauntíma PCR og rauntíma RT-PCR?

Svar: RT-PCR er öfug umritun PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR), sem er mikið notað afbrigði af pólýmerasa keðjuverkun (PCR).Í RT-PCR er RNA þráður öfug umritaður í viðbót DNA, sem síðan er notað sem sniðmát fyrir DNA mögnun með PCR.
Rauntíma-PCR og qPCR(Quantitative Real-ltime-PCR) eru sami hluturinn, báðir eru rauntíma magn PCR, sem þýðir að hver lota PCR hefur rauntíma gagnaskrár, þannig að hægt er að stilla fjölda upphafssniðmáta nákvæmrar greiningar.

Þrátt fyrir að bæði rauntíma PCR (rauntíma fluorescent quantitative PCR) og Reverse Transcription PCR (reverse transcription PCR) virðist vera skammstafað sem RT-PCR, þá er alþjóðasamningurinn: RT-PCR vísar sérstaklega til öfugumritunarPCR, rauntíma PCR er venjulega skammstafað sem qPCR (magnbundin rauntíma PCR).

Og rauntíma RT-PCR (RT-qPCR), það er öfug umritun PCR ásamt flúrljómandi magntækni: Fáðu fyrst cDNA (RT) úr RNA öfugum umritun og notaðu síðan rauntíma PCR fyrir magngreiningu (qPCR).Flestar rannsóknarstofur gera RT-qPCR, það er að segja rannsóknir á RNA tjáningu niður-reglu, þannig að qPCR sem allir tala um á rannsóknarstofunni vísar í raun til RT-qPCR, en ekki gleyma því að enn eru mörg DNA próf í klínískri notkun.Magngreining, svo sem lifrarbólgu B veiru HBV uppgötvun.

Spurning: Eftir að hafa lesið mikið af flúrljómandi magni PCR, hvers vegna ætti að stjórna mögnuðu brotinu á bilinu 80-300bp?

Svaraðu: Lengd hverrar genaröð er mismunandi, sumar eru nokkrir kb, sumar hundruð bp, en við þurfum aðeins að krefjast þess að lengd vörunnar sé 80-300bp við hönnun primers, of stuttir eða of langir henta ekki fyrir flúrljómandi magn PCR greiningu.Vörubrotið er of stutt til að hægt sé að greina það frá primer-dimer.Lengd primer-dimersins er um 30-40bp og erfitt er að greina hvort það er primer-dimer eða vara ef það er minna en 80bp.Ef vörubrotið er of langt, fer yfir 300bp, mun það auðveldlega leiða til lítillar mögnunarvirkni og getur ekki greint magn gensins í raun.

Til dæmis, þegar þú telur hversu margir eru í kennslustofu þarftu aðeins að telja hversu margir munnar eru.Sama gildir þegar þú greinir gen, þú þarft aðeins að greina ákveðna röð af geni til að tákna. Öll röðin mun duga.Ef þú vilt telja fólk þarftu að telja bæði munn og nef, eyru og gleraugu og það er auðvelt að gera mistök.

Til að stækka, í líffræðilegum rannsóknum, eru mörg rannsóknartilvik frá stað til svæðis, vegna þess að genaröðin hvers kyns tegundar er mjög löng, það er óþarfi og ómögulegt að mæla öll brot, svo sem bakteríuröð 16S, sem er að framkvæma íhaldssama röð baktería til að álykta um fjölda ákveðins stofns af bakteríum.

Sp.: Hver er ákjósanlegasta lengdin fyrir qPCR grunnhönnun?

Svaraðu: Almennt talað er primer lengdin um 20-24bp, sem er betra.Auðvitað verðum við að huga að TM-gildi grunnsins þegar grunnurinn er hannaður, því þetta tengist ákjósanlegu glæðuhitastigi.Eftir margar tilraunir hefur verið sannað að 60°C er betra TM gildi.Ef hitastigið er of lágt mun það auðveldlega leiða til ósértækrar mögnunar.Ef glæðingarhitastigið er of hátt verður mögnunarvirknin tiltölulega lág, toppur mögnunarferilsins byrjar seinna og CT gildi seinkar.

Sp.: Hvernig er litunaraðferðin frábrugðin rannsakaaðferðinni?

Svar: LitunaraðferðSum flúrljómandi litarefni, eins og SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, o.s.frv., gefa ekki frá sér ljós af sjálfu sér, en gefa frá sér flúrljómun eftir að hafa bundist minni gróp tvíþátta DNA.Þess vegna, í upphafi PCR viðbragðsins, getur vélin ekki greint flúrljómunarmerkið.Þegar efnahvarfið er komið á glóðunar-framlengingarstigið er tvíþráðurinn opnaður og nýr þráður myndaður undir virkni DNA pólýmerasa og flúrljómandi sameindin binst dsDNA minni grópinni.Eftir því sem PCR-lotum fjölgar eru fleiri og fleiri litarefni sameinuð tvíþátta DNA og flúrljómunarmerkið er einnig stöðugt aukið.Litunaraðferðin er aðallega notuð í vísindarannsóknum.
PS: Vertu varkár þegar þú gerir tilraunina, litarefnið verður að vera sameinað DNA manna, vertu varkár að breyta því í flúrljómandi mann.

Litunaraðferð (vinstri) Kannaaðferð (hægri)
PS: Vertu varkár þegar þú gerir tilraunina, litarefnið verður að vera sameinað DNA manna, vertu varkár að breyta því í flúrljómandi mann.

SYBR Green Ⅰ binst við minni gróp DNA

RannsakaaðferðTaqman rannsakandi er algengasti vatnsrofsneminn.Það er flúrljómandi hópur í 5′ enda rannsakans, venjulega FAM, og rannsakandinn sjálfur er röð sem er viðbót við markgenið.Það er flúrljómandi slökkvihópur í 3′ endanum.Samkvæmt meginreglunni um flúrljómunarorkuflutning (Förster resonance energy transfer, FRET), þegar fréttaskýrandi flúrljómandi hópur (gjafaflúrljómandi sameind) og slökkandi flúrljómandi hópur (viðtakar flúrljómandi sameind) eru spenntir Þegar litróf skarast og fjarlægðin er mjög nálægt gjafaflúormeindinni í dósinni (7-10 mólín) viðtaksameindina, en sjálfflúrljómunin er veik.Þess vegna, í upphafi PCR-hvarfsins, þegar rannsakandinn er laus og ósnortinn í kerfinu, mun skýrslugerandi flúrljómandi hópurinn ekki gefa frá sér flúrljómun.Við glæðingu bindast grunnurinn og rannsakarinn við sniðmátið.Á framlengingarstigi myndar pólýmerasinn stöðugt nýjar keðjur.DNA pólýmerasi hefur 5′-3′ exonucleasa virkni.Þegar komið er í rannsakann mun DNA-pólýmerasinn vatnsrjúfa rannsakann úr sniðmátinu, aðskilja reporter-flúrljómandi hópinn frá quencher-flúrljómandi hópnum og gefa út flúrljómandi merkið.Þar sem það er eitt-á-mann samband á milli rannsakans og sniðmátsins, er rannsakaaðferðin betri en litunaraðferðin hvað varðar nákvæmni og næmi prófsins.Rannsóknaraðferðin er aðallega notuð við greiningu.

Sp.: Hvað er alger magngreining?Hvað er hlutfallsleg magngreining?

Svaraðu: Alger magngreining vísar til útreiknings á upphafsfjölda sýnisins sem á að prófa með qPCR, svo sem hversu margar HBV veirur eru í 1 ml af blóði.Niðurstaðan sem fæst með hlutfallslegri magngreiningu er breyting á magni markgensins í tilteknu sýni miðað við annað viðmiðunarsýni og er genatjáningin upp- eða niður-stýrð.

Sp.: Mun magn RNA-útdráttar, öfugumritunarskilvirkni og mögnunarvirkni hafa áhrif á niðurstöður tilrauna?
Sp.: Mun geymsla sýna, útdráttarhvarfefni, öfug umritunarhvarfefni og ljóssendandi rekstrarvörur hafa áhrif á niðurstöður tilrauna?
Sp.: Hvaða aðferð getur leiðrétt tilraunagögnin?

Varðandi þessi mál munum við lýsa þeim í smáatriðum í háþróaðri og háþróaðri hlutanum hér að neðan.
2. Ítarleg þekking

Með tilliti til rauntíma flúrljómandi magn PCR, verðum við að viðurkenna raunveruleikann að þúsundir vísindarannsókna eru gefnar út á hverju ári, þar á meðal flúrljómandi megindlega PCR tæknin er ekki lítill fjöldi.

Ef það er enginn sameiginlegur staðall til að mæla flúrljómandi magn PCR tilraunina geta niðurstöðurnar verið mjög mismunandi.Fyrir sama gen af ​​sömu tegund, með sömu vinnsluaðferð, verða greiningarniðurstöður einnig mjög mismunandi og erfitt verður fyrir seinkomna að endurtaka sömu niðurstöður.Þú Enginn veit hvað er rétt og hvað er rangt.

Þýðir þetta að flúrljómandi magn PCR sé svindltækni eða óáreiðanleg tækni?Nei, það er vegna þess að flúrljómandi magn PCR er næmari og nákvæmari og smá röng aðgerð mun gefa algjörlega gagnstæðar niðurstöður.Lítið tap er þúsund mílur í burtu.Greinarhöfundur getur verið ítrekað pyntaður af gagnrýnendum.Á sama tíma eiga gagnrýnendur tímaritsins einnig erfitt með að velja úr mismunandi tilraunaniðurstöðum.

Allt í allt, sem bendir til skorts á samstöðu í rauntíma PCR tilraunum.Í þessu skyni byrjuðu háttsettir vísindamenn í greininni að móta staðla,krefjast þess að þátttakendur leggi fram nauðsynlegar tilrauna- og gagnavinnsluupplýsingar (þar á meðal nauðsynleg gögn) í greininni til að uppfylla þessa staðla.

Gagnrýnendur geta dæmt gæði tilraunarinnar með því að lesa þessar upplýsingar;framtíðarlesendur geta líka notað þetta til að endurtaka tilraunina eða bæta tilraunina.Þá eru tilraunaniðurstöður sem fengnar eru með þessum hætti fullar af upplýsingum, hágæða og nothæfar.

MIBBI (Lágmarksupplýsingar fyrir líffræðilegar og lífeðlisfræðilegar rannsóknir -http://www.mibbi.org) varð til.MIBBI er verkefni sem veitir staðla fyrir tilraunir.Það er gefið út í náttúrunni.Þetta verkefni miðar að ýmsum líffræðilegum tilraunum, þar á meðal frumulíffræði, Microarray, qPCR sem við ætlum að fjalla um núna, o.s.frv., og gerir ráð fyrir hverri tegund tilrauna þegar handrit eru lögð inn.Þessar upplýsingar ættu að vera veittar á hverjum tíma.

Í MIBBI verkefninu eru tvær greinar sem tengjast fluorescent quantitative PCR, þ.e.:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – skipulagt tungumál og skýrslugerð fyrir rauntíma magn PCR gögn;
·MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) – lágmarksupplýsingar til að birta greinar um rauntíma megindlegar PCR tilraunir.
Í fyrsta lagi skulum við tala um RDML, hugtakaforskriftina.

Ef ekki er til stöðluð skilgreining á öllu er ómögulegt að halda umræðunni áfram og þess vegna er hugtakaskýring svo mikilvæg í prófinu.
Hugtökin sem notuð eru í flúrljómandi megindlegu PCR tilrauninni innihalda eftirfarandi innihald.QIAGEN hefur gert bestu samantektina fyrir okkur.Eftirfarandi eru öll þurrvörur .

Mögnunarferill
Mögnunarferillinn vísar til ferilsins sem gerð er í PCR ferlinu, með hringrásarnúmerinu sem abscissa og rauntíma flúrljómunarstyrkinn meðan á hvarfinu stendur sem ordinata.

Frábær mögnunarferill ætti að hafa eftirfarandi eiginleika: grunnlínan er flöt eða örlítið lækkuð og engin augljós hækkun er;beygingarpunktur ferilsins er skýr og halli veldisfasans er í réttu hlutfalli við mögnunarvirkni.Því meiri halli, því meiri er mögnunarnýtingin;heildarmögnunarferillinn Samsíðan er góð, sem gefur til kynna að mögnunarvirkni hvers rörs sé svipuð;veldisfasi mögnunarferils sýna með lágstyrkleika er augljós.

Grunnlína (Baseline)
Grunnlínan er hávaðastig fyrri lotunnar, venjulega mæld á milli 3. og 15. lotu, vegna þess að ekki er hægt að greina aukningu flúrljómunargildis af völdum mögnunarafurðarinnar á þessu tímabili.Fjöldi lota sem notaðir eru til að reikna út grunnlínu geta verið mismunandi og gæti þurft að fækka ef mikið sniðmát er notað eða ef tjáningarstig markgensins er hátt.

Til að stilla grunnlínuna þarf að skoða flúrljómunargögn frá línumögnunarferlinum.Grunnlínan er stillt þannig að vöxtur mögnunarferilsins byrjar með lotunúmeri sem er hærra en topptala grunnlínunnar.Setja þarf grunnlínur fyrir hverja markröð fyrir sig.Draga þarf meðalflúrljómunargildin sem greindust í fyrstu lotunum frá flúrljómunargildunum sem fást í mögnuðu afurðunum.Nýjustu útgáfur af ýmsum rauntíma PCR hugbúnaði leyfa sjálfvirka fínstillingu grunnlínustillinga fyrir einstök sýni.

Í fyrstu lotum PCR mögnunarviðbragðsins breytist flúrljómunarmerkið ekki mikið.Að nálgast beina línu er kallað grunnlína, en ef við skoðum vel fyrstu loturnar sjáum við að innan grunnlínunnar er það sem er að gerast á myndinni hér að neðan.

Bakgrunnur Bakgrunnur vísar til
ósértæka flúrljómunargildið í hvarfinu.Til dæmis: óhagkvæm flúrljómun quenching;eða mikill fjöldi tvíþátta DNA sniðmáta vegna notkunar SYBR Green.Bakgrunnsþættir merkisins eru fjarlægðir stærðfræðilega með rauntíma PCR hugbúnaðaralgríminu.

Fréttamaður merki
Fréttaritaramerki vísar til flúrljómunarmerkis sem myndast af SYBR Green eða flúrljómandi merktum raðsértækum rannsaka við rauntíma PCR.

Normalized Reporter Signal (RN)
RN vísar til flúrljómunarstyrks skýrslulitarefnisins deilt með flúrljómunarstyrks óvirka viðmiðunarlitarins mældur í hverri lotu.

Passive Reference Dye
Í sumum rauntíma PCR,flúrljómandi liturinn ROX er notaður sem innri viðmiðun til að staðla flúrljómunarmerkið.Það leiðréttir fyrir breytileika vegna ónákvæmrar pípettingar, holustöðu og flúrljómunarsveiflna á milli brunna.

Flúrljómunarþröskuldur (þröskuldur)
var stillt yfir bakgrunnsgildi og marktækt undir hálendisgildi mögnunarferilsins.Það verður að liggja á línulega svæði mögnunarferilsins, sem táknar log-línulegt svið PCR greiningar.Viðmiðunarmörk ættu að vera stillt í log-mögnunarferlinu þannig að auðvelt sé að greina log-línulega fasa PCR.Ef það eru mörg markgen í rauntíma PCR verður að setja þröskuldinn fyrir hvert mark.Almennt er flúrljómunarmerki fyrstu 15 lotu PCR hvarfsins notað sem flúrljómunarbakgrunnsmerki og flúrljómunarþröskuldur er 10 sinnum staðalfrávik flúrljómunarmerkis fyrstu 3 til 15 lotu PCR, og flúrljómunarþröskuldur er stilltur í veldisvísisfjölgun PCR.Almennt séð er flúrljómunarþröskuldurinn stilltur fyrir hvert tæki fyrir notkun.

Cycle Threshold (CT) eða Crossing Point (CP)
Hringrásin þar sem mögnunarferillinn fer yfir þröskuldinn (þ.e. punkturinn þar sem flúrljómunargreining eykst verulega).CT getur verið brot og hægt er að reikna út magn upphafssniðmáts.CT gildið táknar fjölda lota sem upplifað er þegar flúrljómunarmerkið í hverju PCR hvarfröri nær settum þröskuldi.Það er línulegt samband á milli CT-gildis hvers sniðmáts og logaritma upphafsnúmers afrits sniðmátsins,hærra upphaflega eintaksnúmerið, því minna sem CT gildið er og öfugt.Hægt er að búa til staðlaða feril með því að nota staðal með þekktu upphaflegu afritanúmeri, þar sem abscissa táknar CT gildi, og ordinatan táknar lógaritma upphaflegu afritsnúmersins.Þess vegna, svo framarlega sem CT gildi óþekkta sýnisins er fengið, er hægt að reikna upphaflega afritsnúmer sýnisins út frá staðlaða ferlinum.

ΔCT gildi
ΔCT gildi lýsirmunurinn á markgeninu og samsvarandi innrænu viðmiðunargeninu CT gildi, eins og heimilisgen, og er notað til að staðla magn sniðmáts sem notað er:
⇒ΔCT = CT (markgen) – CT (innrænt viðmiðunargen)

ΔΔCT gildi
ΔΔCT gildið lýsir muninum á meðal ΔΔCT gildi sýnis sem vekur áhuga (td örvuðum frumum) og meðal ΔΔCT gildi viðmiðunarsýnis (td óörvuðum frumum).Viðmiðunarsýnið er einnig kallað kvörðunarsýni og öll önnur sýni eru staðlað á þetta til hlutfallslegrar magngreiningar:
⇒ΔΔCT = meðaltal ΔCT (sýnishorn af áhuga) – meðaltal ΔCT (viðmiðunarsýni)

Innræn viðmiðunargen (innræn viðmiðunargen)
Tjáningarmagn innrænna viðmiðunargena, eins og húshaldsgena (húshaldsgen), er ekki mismunandi milli sýna.Með því að bera saman CT gildi viðmiðunargensins við markgenið er hægt að staðla tjáningarstig markgensins við magn inntaks RNA eða cDNA (sjá kaflann um ΔCT gildi hér að ofan).

Innri tilvísunargen rétt fyrirhugsanlegt niðurbrot RNA eða tilvist ensímhemla í RNA sýnum, auk breytileika í RNA innihaldi, skilvirkni öfugumritunar, endurheimt kjarnsýra og meðhöndlun sýna.Til að velja ákjósanlegasta viðmiðunargenið breyttum við reikniritinu til að leyfa val þess á bestu viðmiðuninni sem fer eftir tilraunastillingunni.

Innra eftirlit
Viðmiðunarröð sem er mögnuð upp í sama hvarfi og markröðin og rannsakað með öðrum rannsaka (þ.e. að framkvæma tvíhliða PCR).Innra eftirlit er oft notað til að útiloka misheppnaða mögnun, svo sem þegar markröðin greinist ekki.
Kvörðunarsýni
Viðmiðunarsýni (til dæmis hreinsað RNA úr frumulínu eða vef) notað í hlutfallslegri magngreiningu til að bera saman öll önnur sýni til að ákvarða hlutfallslegt tjáningarstig gena.Kvörðunarsýnið getur verið hvaða sýni sem er, en er venjulega viðmiðunarsýni (til dæmis ómeðhöndlað sýni eða sýni frá tíma núll tilraunarinnar).

Jákvæð eftirlit
nota stjórnviðbrögð meðþekkt magn af sniðmáti.Jákvæð eftirlit er oft notað til að athuga hvort grunnsett eða grunnrannsóknarsett virki rétt og að hvarfið sé rétt uppsett.

Engin sniðmátsstýring (NTC)
Stýrihvarf sem inniheldur alla nauðsynlega þætti mögnunarhvarfsins nema sniðmátið, sem venjulega er skipt út fyrir vatn.Notkun NTC getur fundið mengun af völdum hvarfefnamengunar eða erlends DNA og tryggir þannig áreiðanleika og áreiðanleika greiningargagnanna.Mögnun á NTC-stýringunni gefur til kynna mengun.

Engin RT stjórn (NRT)
RNA útdráttarferli getur innihaldið leifar af erfðafræðilegu DNA, sem er afar skaðlegt og er sökudólgurinn sem hefur áhrif á gagnagæði og náttúrulegan óvin qPCR, þannig að við hönnun tilrauna verður það að vera hannað til að magna aðeins upp RNA uppgötvun.Það eru tvær leiðir, önnur er að hanna primera þvert á introns, hin er að fjarlægja DNA algjörlega, hvor er betri, sem verður fjallað um síðar.NTR stjórnin er töfraspegill til að greina DNA mengun.Ef það er mögnun þýðir það að það er mengun.

Staðlar
Staðlar eru sýni með þekktum styrk eða afritafjölda sem eru notuð til að búa til staðlaðan feril.Til að tryggja stöðugleika staðalsins er genabrotið venjulega klónað inn í plasmíðið og notað sem staðall.

Staðalferillinn
er venjulega þynnt í að minnsta kosti 5 styrkleikahalla með stöðluðu vörunni í samræmi við tvöföldunarhlutfallið, og 5 punktar eru teiknaðir í hnit CT gildi og afritatölu og punktarnir eru tengdir til að mynda línu til að búa til staðlaðan feril.Fyrir hverja staðlaða feril þarf að athuga réttmæti hennar.Hallagildið er á milli –3,3 og –3,8 og hver styrkur er gerður í þríriti.Fara skal punktum sem eru verulega frábrugðnir öðrum punktum.CT gildi sýnisins sem á að prófa er sett inn í staðlaða ferilinn og hægt er að reikna út tjáningarstig sýnisins sem á að prófa.

CT gildi sýnisins sem á að prófa er fært inn í staðlaða ferilinn og hægt er að reikna út upphaflega eintaksnúmer sýnisins sem á að prófa.

Skilvirkni og halli
Halli staðalferilsins táknar skilvirkni rauntíma PCR.
· Halli upp á -3,322 gefur til kynna að PCR mögnunarvirkni sé 1, eða 100% skilvirk, og magn PCR afurðar tvöfaldast í hverri lotu.
· Halli minni en –3,322 (td –3,8) gefur til kynna PCR skilvirkni
· Halli sem er meiri en –3,322 (td –3,0) gefur til kynna að PCR skilvirkni virðist vera meiri en 100%, sem er forvitnilegt, hvernig gæti ein PCR lota myndað meira en tvöfalda magnaða vöruna?Þetta ástand á sér stað í ólínulega fasa PCR hvarfsins, það er, það er mikið magn af ósértækri mögnun.

bræðsluferill
Eftir að qPCR mögnun er lokið er PCR afurðin hituð.Þegar hitastigið hækkar bráðnar tvíþátta mögnunarafurðin smám saman, sem leiðir til lækkunar á flúrljómunarstyrk.Þegar ákveðnu hitastigi (Tm) er náð mun mikill fjöldi vara bráðna.Flúrljómun lækkar verulega.Mismunandi PCR vörur hafa mismunandi Tm gildi og mismunandi bræðsluhitastig, þannig að hægt sé að greina sérstöðu PCR.

Bræðsluferill (afleiðuferill)
Bræðsluferillinn er unninn til að mynda toppkort, sem getur sýnt á innsæi hátt ástand PCR vörubrota.Þar sem bræðsluhitastig er Tm gildi DNA brotsins, er hægt að dæma nokkrar breytur sem hafa áhrif á Tm gildi DNA brotsins, svo sem bútastærð, GC innihald osfrv. Almennt séð, samkvæmt grunnhönnunarreglum okkar,lengd mögnuðu vörunnar er á bilinu 80-300bp, þannig að bræðsluhitastig ætti að vera á milli 80°C og 90°C.

Túlkun bræðsluferilsins: Ef eini aðaltoppurinn kemur fram á milli 80°C-90°C þýðir það að flúrljómandi magn PCR sé fullkomið;ef aðaltoppurinn kemur fram á milli 80°C-90°C og ýmsir toppar koma fram undir 80°C, er í grundvallaratriðum litið til primer dimersins.Þú getur reynt að auka glæðingarhitastigið til að leysa það;ef aðaltoppurinn kemur fram á bilinu 80°C-90°C og ýmsir toppurinn kemur aftur þegar hitastigið hækkar, er í grundvallaratriðum talið að um DNA mengun sé að ræða og þarf að fjarlægja DNA á upphafsstigi tilraunarinnar.

Auðvitað eru enn nokkrar óeðlilegar aðstæður, sem verða sundurliðaðar eitt af öðru hér að neðan.
3. Háþróuð þekking

Til að gera qPCR, verð ég að segja MIQE,Lágmarksupplýsingartil útgáfu áMagnbundiðRauntíma PCRTilraunir — lágmarksupplýsingar til að birta greinar um rauntíma magn PCRtilraunir.Til þess að einfalda skilning allra munum við einfalda lykilinntakið.

Hægt er að leita í upprunalegum texta MIQE á netinu og það mikilvægasta er að hann kveði á umgagnagátlisti sem þarf að koma fram við birtingu greinar .

Gagnrýnendur geta dæmt gæði tilraunarinnar með því að lesa þessar upplýsingar;framtíðarlesendur geta líka notað þetta til að endurtaka eða bæta tilraunina.
Þess má geta að í þessum lista er mikilvægi hvers lista merkt með E eða D í sömu röð.Hvað þýðir það?E: nauðsynlegar upplýsingar (verður að leggja fram);D: æskilegar upplýsingar (veittu eins mikið og mögulegt er).

MIQE (1)—Experimental Design
Margir skíthælar sem hafa lokið vörninni eftir að hafa lokið framhaldsnámi vita ekki hvernig á að hanna tilraun sjálfstætt, opna minnisbækurnar sínar og gera það sem kennarinn segir þeim að gera.Fyrir vikið var tilraunahönnunin ekki ströng og sagði ritstjórn blaðsins að þeir vildu smíða þessa mynd og þessa mynd svo þeir gerðu þetta í lausu lofti.Svona eru skúrkarnir búnir til!

Nær heimilinu er fyrsta meginreglan í tilrauninni að ákvarðastrangleiki tilraunalógíkarinnar.Grundvallaratriðið er tilraunahönnunin og það mikilvægasta við tilraunahönnunina er hvernig á að stilla marksýni, viðmiðunarúrtak (viðmiðunarúrtak) og fjölda endurtekninga, þannig að hægt sé að vísa í tilraunagögnin, bera saman og sannfærandi.

Marksýnishorniðvísar til sýnisins sem krefst þess að við greinum markgenið eftir ákveðna meðferð.Viðmiðunarsýniðer sýnið án nokkurrar meðferðar, sem oft er nefnt villigerð í líffræði.

Tilraunaendurtekningareru mjög mikilvægar.Almennt þarf fjöldi sannfærandi endurtekna að vera fleiri en þrjár.Það er nauðsynlegt að greina hvað er líffræðileg afritun og hvað er tæknileg afritun.

Líffræðilegar endurtekningar: Sama sannprófunartilraun gerð með mismunandi efni (tími, plöntur, lotur, hvarfplötur).

Líffræðileg fjölföldun
Tökum varnarefnameðferð pipars sem dæmi.Við viljum úða skordýraeitri á þrjár plöntur ABC, þá eru þrjár plöntur ABC þrjár líffræðilegar endurtekningar og þær eru sama sannprófunartilraunin sem gerð er með mismunandi efnum.En sem tilraun er vissulega þörf á samanburði, svo við getum úðað einni af greinum plöntu A til að mynda tilraunahóp af plöntu A, en ekki úðað öðrum greinum plöntu A til að mynda samanburðarhóp.Gerðu það sama fyrir B og C.

Tæknilegar endurtekningar (tæknilegar endurtekningar): Þetta er endurtekin tilraun sem er hönnuð til að forðast villur af völdum aðgerða, sem er í raun tvítekið gat sem er í sama efni.Bæði meðferðir og eftirlit verða að hafa endurteknar stillingar (að lágmarki þrjár) markgensins og innra viðmiðunargensins.

Tæknileg endurtekning
Taktu piparinn sem er meðhöndlaður með skordýraeitri sem dæmi aftur.Fyrir tilraunahóp plöntu A gerðum við þrjú PCR holur af 1, 2 og 3 fyrir markgenið og innra viðmiðunargenið í sömu röð, til að taka meðaltalið eftir greiningu.Til að stjórna plöntu A eru hópar einnig meðhöndlaðir á sama hátt.Á sama hátt skaltu gera sömu meðferð fyrir B og C plöntur.Þetta er tæknileg endurtekning.

Það er rétt að taka það framþað sem kemur inn í tölfræðina er líffræðilega endurtekningin og tæknilega endurtekningin er að prófa hvort einhver tilviljunarkennd fyrirbæri séu í tilraunaferlinu, til að gera tilraunaniðurstöðurnar trúverðugar, það er að segja að forðast villur með því að taka meðaltal þeirra eins og við segjum oft.

Neikvæðar stýringar—NTC og NRT
NTC (No-Template Control), eftirlit án sniðmáts, er notað til að sannreyna hvort tilraunaefnið sé mengað.Almennt er vatn notað sem sniðmát.Ef það er flúrljómandi viðbrögð bendir það til þess að kjarnsýrumengun hafi átt sér stað á rannsóknarstofunni.

Þessi mengun kemur frá: óhreinu vatni, óhæfum hvarfefnum sem innihalda innrænt DNA, grunnmengun, mengun á rannsóknarstofubúnaði, úðabrúsa, osfrv., þarf að nota RNase hreinsiefni og RNase hemla.Erfiðast er að finna mengun í úðabrúsum.Ímyndaðu þér að rannsóknarstofan þín sé eins og smog, með ýmsar kjarnsýrur í loftinu.

NRT (No-Reverse Transcriptase), viðmiðið án öfugumritunar, er óafritað RNA sem neikvæð viðmiðun, sem er stjórn á gDNA leifum.

Þegar genatjáning er stunduð er magn RNA greint með því að greina magn cDNA eftir öfuga umritun.Ef það er gDNA leifar þegar RNA er hreinsað mun það valda villum í tilraunaniðurstöðum, vegna þess að raunverulegar niðurstöður sem fást eru gDNA og cDNA.Á heildarstigi, ekki bara cDNA, þarf að fjarlægja gDNA alveg við útdrátt RNA.

MIQE (2)—sýnishornsupplýsingar
Svokallaðar sýnishornsupplýsingar þýðir að þegar við birtum grein um qPCR verðum við að útskýra sýnishornsupplýsingarnar á skýran hátt, sem er ómissandi hluti greinarinnar.Á sama hátt, þegar við vinnum úr sýni, verðum við einnig að stjórna eigin starfsemi til að tryggja réttmæti sýnanna.

Lýsingin á sýninu er aðeins niðurstaða og við ættum að gefa meiri gaum að efnum sem tekin eru í allri tilrauninni.

Val á tilraunaefnum
Blóðsýni – veldu ferskt blóð, ekki lengur en 4 klst.Frumusýni – veldu að safna ferskum frumum á tímum kröftugs vaxtar.Dýravefur—Veldu ferskan, kröftuglega vaxandi vef.Plöntuvef - Veldu ferskt, ungt vef.

Þú hlýtur að hafa tekið eftir því að það er lykilorð í þessum fáu setningum: ferskt .
Fyrir ofangreind sýni er besta, hagkvæma og stöðugasta settið á markaðnum Foregene's Kit, sem getur fljótt og auðveldlega dregið út DNA og RNA þeirra.

Blóð DNA Mini Kit

Cell Total RNA Einangrunarsett

Animal Total RNA einangrunarsett

Plant Total RNA Einangrunarsett

Plant Total RNA Isolation Kit Plus

Plant DNA einangrunarsett

Geymsla tilraunaefna
Almennt séð mælum við ekki með því að geyma sýni ef aðstæður leyfa.Hins vegar eru margir vinir sem geta ekki gert tilraunir strax eftir sýnatöku og sumir þurfa jafnvel að bera fljótandi köfnunarefnisgeyma á völlinn til sýnatöku.

Fyrir svona vinnusaman vin, get ég bara sagt að þú skilur ekki hvarfefnisneysluvörur.Nú framleiða mörg hvarfefnisneyslufyrirtæki hvarfefni sem geta geymt RNA sýni við stofuhita og þú getur valið að nota þau.Hefðbundin geymsluaðferð er geymsla á fljótandi köfnunarefni, með litlum fljótandi köfnunarefnisgeymi sem auðvelt er að bera með sér.Eftir að sýnið hefur verið komið aftur á rannsóknarstofuna skal geyma það í -80°C kæli.

Fyrir tilraunir með RNA verður að fylgja sex orða meginreglunni:lágt hitastig, engin ensím,oghratt .

Hugmyndin um lágt hitastig er auðvelt að skilja;án ensíma er RNase alls staðar í heiminum sem við búum í (annars hefði þú verið drepinn af HIV), þannig að hvernig á að forðast RNase þegar gera tilraunir er mjög mikilvægt hugtak;hratt,Það er ekkert Kung Fu í heiminum sem ekki er hægt að brjóta, aðeins hraða er ekki hægt að brjóta.

Þess vegna, í vissum skilningi, því styttri útdráttartími, því betra er settið.Hvers vegna gerirForegeneKit 's leggja áherslu á hraða, vegna þess að þeir vita það vel.

PS: Sumar stúlkur gera tilraunir mjög vandlega, en þær eru ekki eins góðar og slamdunk eftir margra ára vinnu.Þeim finnst Guð vera ósanngjarn, kvarta yfir öðrum og leita að lífi.Reyndar skildi hún það ekki.Hann verndaði RNA ekki vel og slamdunk spilarinn var lipur.Þegar hann var að gera tilraunina hélt hann að hann myndi klára skellinn með þrisvar sinnum, fimm sinnum og tveimur skiptingum, en hann gerði tilraunina vel.

Athugið: Hægari, meiri líkur á RNase innrás.Hvernig á að þjálfa þig í að vera fljótur?Það er engin leið, bara æfa meira.

Fyrir mismunandi tilraunir og mismunandi sýni er samt nauðsynlegt að lesa fleiri bókmenntir og velja viðeigandi vinnsluaðferð.Fyrir sýnisöfnun og geymsluferlið krefst MIQE að það verði skýrt skrifað í blaðið, svo að gagnrýnendur geti farið yfir áreiðanleika blaðsins, og það er líka þægilegt fyrir undrandi ungmenni að endurtaka tilraunina þína.

Þó að líffræðilegar tilraunir séu erfiðar eru þær hágæða.Ef þú ferð ekki varlega geturðu kollvarpað heiminum.Til dæmis að gera SARS að lífefnafræðilegri kreppu eða búa til blendingshrísgrjón til að bjarga 1,3 milljörðum manna.Myndin hér að neðan er efnafræðileg tilraun, þú ættir að skilja hversu stoltur þú ert af rannsóknum þínum bara með því að horfa á útlit hans eins og pikk.Gleymdu því, ekki svertu hann.

MIQE (3) – kjarnsýruútdráttur.
Kjarnsýruútdráttur er stór viðburður og allar sameindalíffræðitilraunir byrja með kjarnsýruútdrætti.Fyrst af öllu skulum við afrita efni MIQE um kjarnsýruútdrátt.

Þegar þú horfir á þetta form geturðu ekki verið á yfirborðinu.Formið er dogma.Til að vera fremsti nemandi verður þú að spyrja hvers vegna.Meginefni þessarar töflu er: Stundahreinleika, heilleika, samkvæmni og útdráttarmagn RNA .

Fyrsti hluti afferli eða tæki er kjarnsýruútdráttarskrefið.Ef þú notar sjálfvirkan kjarnsýruútdrátt til að draga út (háþróaður, vinsamlegast hafðu samband við mig til að kaupa) þarftu að tilgreina tegundarheiti tækisins.

Nafn settsins og

hvaða sett var notað fyrir breytingarnar, hvaða sérstökum hvarfefnum var bætt við eða hvaða sérstakar aðgerðir voru gerðar ætti að útskýra með skýrum hætti svo aðrir geti auðveldlega endurtekið tilraunina þína.

Sumir bæta við sérstökum hvarfefnum þegar þeir draga út sérstök sýni, halda að þetta sé leynivopnið ​​þeirra og segja öðrum ekki frá því.Á meðan þeir halda því leyndu missa þeir líka tækifærið til að láta greinina þína skína.Ekki vera snjall, þú verður að vera heiðarlegri en landsgamli Zhang í vísindarannsóknum, ef þú vilt vera snjall mun greinin gera þig heimskan.

verður að muna vörunúmer settsinsþegar þú pantar settið og skrifar greinina.Það eru almennt tvö númer á settinu: Köttur—vörulistanúmer (vörunúmer, vörunúmer), Lot—vörulotunúmer (Notað til að gefa til kynna úr hvaða lotu varan kom).

Að auki er CAS-númerið oft notað þegar lífefnafræðileg hvarfefni eru pantuð og ég mun gera það vinsælt saman.CAS-númerið er númerið sem American Chemical Society gefur hverju nýju efnafræðilegu lyfi.Yfirleitt eru þrjár tölur tengdar með striki.CAS númer Rushui: 7732-18-5.Efni hafa oft mörg samheiti, en CAS-númerið er einstakt.Þegar þú pantar lyf geturðu athugað CAS númer þess fyrst.

Nær heimilinu, hvers vegna þurfum við að lýsa þessum hlutum skýrt?Reyndar er það líka til að athuga gæði RNA útdráttar.Notkun tækja og setta mun gera útdrátt RNA stöðugri.Útdráttur mælikvarði venjulegra rannsóknarstofa er ekki stór, og það er hægt að fá það með pökkum.

Upplýsingar um DNase eða RNase meðferð
Mikilvæga spurningin um flúrljómandi magn PCR er að koma í veg fyrir DNA mengun og ekki gera tilraunir ef það er mengun.Þess vegna er mikilvægt að tilgreina ferlið sem þú notaðir til að vinna úr DNA, til að sýna fram á að DNA í tilraunaferlinu hafi verið fjarlægt að fullu.táknað með skýringarmynd.

Skýringarmynd af RNA og DNA
Almennt séð er aðferðin til að fjarlægja DNA að meðhöndla RNA með DNase eftir útdrátt.Hins vegar eru þetta tiltölulega gamlar aðferðir.Viðskiptasett RNA útdráttarsett hefur tekist að fjarlægja DNA meðan á útdráttarferlinu stendur án þess að bæta við DNase.Til dæmis, röð af pökkum frá Foregene.

Athugið: Að fjarlægja DNA við RNA-útdrátt er mjög hættulegt tvíeggjað sverð, sem mun lengja vinnslutíma RNA-útdráttar og auka hættu á niðurbroti RNA.Í grundvallaratriðum er það skipting milli RNA ávöxtunar og hreinleika.

Að auki er magn af DNase sem bætt er við kísil-undirstaða aðsogssúluna mjög lítið og hágæða DNase verður að nota til að ná fram áhrifunum.Ekki er hægt að melta óhagkvæman DNase fljótt og fullkomlega.Þetta er próf á tæknistigi kaupmannsins.Auðvitað eru enn skrýtnari kaupmenn sem státa af því að hægt sé að fjarlægja DNA án DNase.Það má segja að allir sem stæra sig af því að hægt sé að fjarlægja DNA algjörlega án DNase sé húllan.DNA er tiltölulega stöðugt tvíþátta mannvirki og það er ekki hægt að eyða því bara með því að tala og hlæja.

Mengunarmat
matsaðferð: rafdráttargreining, 1% agarósa, 6V/cm, 15min, hleðsla 1-3 ul

Kjarnsýra magngreining
er venjulega mælt með UV litrófsmæli.Leyfðu mér fyrst að gera vinsæla merkingu þriggja gilda OD260, OD280 og OD230.
·OD260nm: Það er frásogsbylgjulengd hæsta frásogstopps kjarnsýru og besta mælda gildið er á bilinu 0,1 til 1,0.Ef ekki, þynntu eða þynntu sýnið til að koma því innan marka.
·OD280nm: Það er frásogsbylgjulengd hæsta frásogstopps próteina og fenólefna.
·OD230nm: Það er frásogsbylgjulengd hæsta frásogstopps kolvetna.

Næst skulum við tala um hlutverk hvers vísis.Fyrir A260 er hægt að nota það til að mæla ávöxtun kjarnsýru.Þegar OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

Fyrir hreinleika þurfum við að skoða hlutföllin sem við sjáum almennt: OD260/280 og OD260/230.
·Hreint DNA: OD260/280 er um það bil jafnt og 1,8.Þegar það er meira en 1,9 gefur það til kynna að um RNA-mengun sé að ræða og þegar það er minna en 1,6 gefur það til kynna að það sé prótein- og fenólmengun.
·Hreint RNA: 1,7
·OD260/230: Hvort sem það er DNA eða RNA, þá er viðmiðunargildið 2,5.Þegar það er minna en 2,0 gefur það til kynna að það sé mengun af sykri, salti og lífrænum efnum.

RNA heilleika

Það er mjög mikilvægt að mæla heilleika RNA.Almennt er nauðsynlegt að gera tilraun með RNA denaturation gel til að athuga hvort birta á milli 28S og 18S RNA sé tvíþætt tengsl.Þegar þriðja bandið 5S kemur fram þýðir það að RNA er byrjað að brotna niður, nema hryggleysingja.

Gögn fyrir RNA-gæðamat: Til viðbótar við ofangreindar prófanir eru einnig til nokkur fullkomnari tækjapróf með tilliti til RNA-heilleika, eins og RQI-heilleikapróf Experion sjálfvirka rafdráttarkerfisins, sem getur greint hvort RNA er brotið niður ósýnilega.

Í vísindarannsóknum er flúrljómandi magn PCR samanburður á markgeninu og innra viðmiðunargeninu.Þess vegna, í því ferli að varðveita RNA sýni, RNA útdrátt osfrv., er aðalmarkmiðið að tryggja heilleika RNA.

Hvernig heilleiki RNA hefur áhrif á jafnvægið milli markgensins og innra viðmiðunargensins má auðveldlega skilja af myndinni hér að neðan.Niðurbrot mun leiða til ófullkominnar gena, hvort sem það er ófullnægjandi innra viðmiðunargensins eða ófullkomleika markgensins, mun það hafa mikil áhrif á gögnin.

Skýringarmynd af markgeni og viðmiðunargeni, má ekki vera satt

Hindrunarpróf (hvort CT gildi er bælt við háa eða lága styrk eða aðrar aðstæður)

Ef þessi mynd er tekin sem dæmi, eru Ct gildi ferilanna fimm sem hér segir.Dreifing CT-gilda á milli ferlanna er ójöfn og Ct-gildin seinka við háan og lágan styrk, sem er tilfelli PCR-hömlunar.

Lykilatriði: Í ferli RNA útdráttar þurfum við að yfirgefa ranghugmyndir og koma á réttum.

Röng hugmynd er: RNA-útdráttur sækir aðeins eftir afraksturinn og heldur að því meira magn af RNA sem fæst, því betra.Reyndar, þegar við gerum magngreiningu, ef fjöldi gena er ekki mjög mikill, þurfum við ekki mikið RNA.Magn RNA sem þú dregur út er meira en nóg.

Rétt hugtak er:RNA útdráttur ætti að sækjast eftir hreinleika, heilindum og samkvæmni.Hreinleiki getur tryggt að síðari öfug umritun sé ekki hindruð og gögnin verða ekki fyrir áhrifum af DNA.Heiðarleiki tryggir jafnvægi milli markraða og innri tilvísana.Samræmi tryggir stöðuga hleðslu sýna.

MIQE (4) – öfug umritun
Misskilningur: leit að hærra sýnisrúmmáli.
Rétt hugtak: Leitið eftir samkvæmni (stöðugleika), óháð því magni RNA sem er hlaðið, skilvirkni öfugumritunar helst í samræmi, sem tryggir að munur á cDNA getur sannarlega endurspeglað mun á mRNA.
Við útskýrum þetta ferli með skýringarmynd:

Skýringarmynd af öfugum umritun skilvirkni, er ekki satt
Fyrst af öllu þurfum við að skilja muninn á öfugri umritunarferlinu og PCR ferlinu.PCR fer í gegnum margvíslega hitunar- og glæðingarferli og markbúturinn vex veldisvísis;þó að öfug umritun hafi ekki þetta ferli, getum við ímyndað okkur að öfug umritun sé í raun einn á móti einum Meðan á afritunarferlinu stendur, eins og margir stykki af RNA

eins og það er hægt að fá eins mörg stykki af cDNA-upplýsingum, ætti það að vera ljóst núna, vegna þess að brot stór og smá hafa verið öfug- umrituð og það er ómögulegt að einblína á eitt brot.Og vegna þess að magn RNA er tiltölulega lítið er magn cDNA sem fæst einnig tiltölulega lítið, ólíkt PCR, sem hefur mögnunaráhrif, svo það er í grundvallaratriðum ómögulegt að greina.

Niðurstöður cDNA rafdráttar
Í öðru lagi, helst er öfug umritun framkvæmd einn á móti einum, en enginn öfug umritun frá neinu fyrirtæki getur náð þessum áhrifum.Í grundvallaratriðum reikar skilvirkni flestra bakrita á milli 30-50%.Ef þetta er raunin, viljum við frekar hafa tiltölulega stöðuga öfugumritunarvirkni, sem er það sem við viljum sjá á myndinni: 3 RNA fá 2 cDNA, 6 RNA fá 4 cDNA, þannig að sama hversu mikið sýni er hlaðið er öfug umritun skilvirkni tiltölulega stöðug.Við viljum ekki sjá ástandið þar sem skilvirkni öfugumritunar er óstöðug og mikil þéttni er hindruð.

Svo, hvernig á að sannreyna hvort öfug umritun skilvirkni sé stöðug?Aðferðin er mjög einföld, þú þarft aðeins að gera samanburðarpróf: annað er að öfuga umritun í cDNA eftir tvöföldun þynningar á RNA, og hin er að gera tvöfalda þynningu eftir öfuga umritun í cDNA og gera síðan qPCR til að sjá hallann sem fæst.Sem fremsti nemandi ættir þú að skilja það á nokkrum sekúndum.Eins og sýnt er hér að neðan:

Þynning á RNA og cDNA til að prófa hvort skilvirkni öfugumritunar sé stöðug
Reverse transcriptase og kit
Hvernig getur fullkomið flúrljómandi magn PCR haft framúrskarandi bakrit og sett.Bakriti skiptist í grófum dráttum í tvær tegundir eftir uppruna, AMV eðaM-MLV, og árangur þeirra er sá sami og sýndur er í töflunni.

RNase H virkni
RNase H er Ribonuclease H, kínverska nafnið er ribonuclease H, sem er endoribonuclease sem getur sérstaklega vatnsrofið RNA í DNA-RNA blendingskeðjunni.RNase H getur ekki vatnsrofið fosfódíestertengin í einþátta eða tvíþátta DNA eða RNA, það er, það getur ekki melt einþátta eða tvíþátta DNA eða RNA.Almennt notað við myndun annars strengs cDNA.

Það er skrítið.Við segjum að bakrit hafi RNase H virkni, ekki að bakrit innihaldi RNase H, og það er kannski ekki hægt að aðskilja RNase H frá bakriti, kannski vegna sköpulags ákveðinna hópa í bakriti Þessi virkni stafar af bakritinu.

Þess vegna, óháð meiri öfugumritunarvirkni AMV, dregur RNase H virkni þess úr afrakstur cDNA.Að sjálfsögðu eru framleiðendur hvarfefna stöðugt að fínstilla vörur sínar til að útrýma RNase H virkni í bakriti eins mikið og mögulegt er til að auka afrakstur cDNA.
Hreinsunarhitastig

Aukabygging RNA við mismunandi hitastig
Sjá myndina hér að ofan fyrir aukabyggingu RNA við mismunandi hitastig og notaðu mFold nettólið til að ákvarða aukabyggingu markbútsins við sérstakar hita- og saltstyrksskilyrði.Við 55°C er aukabygging RNA enn mjög flókin, bakrit getur ekki virkað og aukabyggingin er ekki hægt að leysa að fullu fyrr en 65°C, á meðan kjörhiti AMV og M-MLV er mun lægra en þetta hitastig.
hvað skal gera?Auka uppbyggingin er viðbótarpörun sniðmátsins sjálfs, sem leiðir til mikillar samkeppni á milli primer og bakrita og sniðmátsins, sem leiðir til röð vandamála eins og lágt E og lélega endurtekningarnákvæmni.

hvað skal gera?Auka aðeins glæðuhitastigið eins mikið og mögulegt er.

Margir framleiðendur hvarfefna eru að bæta öfugt umrit með erfðatækni.Sumir hækka hvarfhitastigið, eins og Jifan og Aidelai, og sumir fjarlægja virka hópinn af RNase H ensími til að bæta sækni ensímsins og RNA sniðmátsins.Mikil sækni getur samkeppnishæft kreist út aukabygginguna og lesið í gegn mjúklega, og einnig bætt verulega skilvirkni öfuguppskriftar.
Lykilatriði: Öfug umritun er mikilvægari til að sækjast eftir samkvæmni öfugumritunar skilvirkni (ensím verða ekki aðeins að vera skilvirk heldur einnig stöðug), frekar en magn sýnis sem hlaðið er, ef það er ekki sérstaklega stórfelld flúrljómandi magn PCR, verður það alls ekki mögulegt.Mörg cDNA.
Ýmsir framleiðendur hafa einnig lagt sig fram við að leita að samræmi.Til dæmis hafa flest fyrirtæki nú pakkað öfugri umritun sem venjulegu setti til sölu, sem er góður kostur.
Til dæmis, Foregene's RT Easy Series pökkum:

RT Easy I (Master premix fyrir fyrsta streng cDNA nýmyndunarsett)

MIQE (5) – upplýsingar um markgen

Myndin hér að ofan útskýrir
1. Hvort þetta gen er virkt fyrir endurteknar tilraunir er almennt hægt að sannreyna með endurteknum tilraunum.
2. Gena auðkenni, þú veist.
3. Lengd gena, heildarlengd markgensins er örugglega ekkert vandamál.Þegar grunnur er hannaður skaltu ganga úr skugga um að lengd amplicons sé á milli 80-200bp til að tryggja betri mögnunarvirkni.
4. Sequence Blast samanburðarupplýsingar, markgenið þarf að bera saman í genabanka til að koma í veg fyrir ósértæka mögnun.
5. Tilvist gerviefna.Gerviefni er DNA röð sem líkist venjulegu geni en missir eðlilega virkni.Það er oft til í fjölgena fjölskyldu heilkjörnunga.Það er venjulega táknað með ψ.Það er óvirkt erfðafræðilegt DNA eintak í erfðamenginu sem er mjög líkt erfðaefnisröðinni., eru almennt ekki umritaðar og hafa enga skýra lífeðlisfræðilega merkingu.
6. Staðsetning frumra miðað við exons og introns.Fyrstu árin, þegar við leystum vandamálið með DNA-mengun, gáfum við oft athygli á staðsetningu frumra, úteininga og innrana, og almennt íhuguðum við að hanna frumra þvert á intron til að forðast DNA mögnun.Vinsamlega sjá myndina hér að neðan: svartur táknar innrauða, ýmsir bláir táknar exonar, bleikur táknar algengar frumur og skærrauður táknar innrauða fruma.

Skýringarmynd, aldrei satt
Þvílík fullkomin áætlun virðist þetta, en í raun eru trans-intron primers ekki eins töfrandi og ímyndað var og þeir munu líka valda ósértækri mögnun.Þannig að besta leiðin til að koma í veg fyrir DNA mengun er að fjarlægja DNA alveg.
7. Sköpunarspá.Notaðu þetta dæmi aftur, notaðu mFold nettólið til að ákvarða aukabyggingu markhlutans við tiltekið hitastig og saltstyrk.

Aukabygging RNA við mismunandi hitastig
Auka uppbyggingin er viðbótarpörun sniðmátsins sjálfs, sem mun leiða til mikillar samkeppni á milli grunnpörunar og sniðmátapörunar, og líkurnar á primerbindingu eru minni, sem leiðir til fjölda vandamála eins og lágs E og lélegrar endurtekningarhæfni.Í gegnum hugbúnaðarspá, ef það er ekkert aukabyggingarvandamál, þá væri það frábært.Ef svo er mun eftirfylgnigrein okkar fjalla sérstaklega um hvernig eigi að leysa þetta vandamál.

MIQE (6)—qPCR fákirni

Fyrir flúrljómandi magn PCR er það fyrsta sem þú glímir við á hverjum degi RNA útdráttur, og annað getur verið grunnhönnun.
Í fyrsta lagi skoðum við reglurnar um grunnhönnun samkvæmt MIQE gátlistanum.Það er svo einfalt að skítkastarnir geta hlegið, og við getum klárað það í einni setningu: komist að röð og staðsetningu grunnprófans og breytingaaðferðina.Fyrir grunnhreinsunaraðferðina er nýmyndun grunns svo ódýr um þessar mundir, qPCR er verðugt PAGE og yfir hreinsunaraðferðum og upplýsingar um nýmyndunartækið eru ekki mikilvægar.Margir hafa stundað primera í áratugi og vita ekki að hljóðgervillinn er ABI3900.
Varðandi meginreglur grunnhönnunar, þá þarftu ekki að leggja þær á minnið, vegna þess að flestir grunnhönnunarhugbúnaður eða netverkfæri geta séð um þessi vandamál (ráðlagt nettól primer3.ut.ee/), og 99,999% af grunnhönnun er ekki unnin handvirkt. Sjáðu, höfundurinn hannar stundum hundruð grunna á dag, ef þú lest einn og einn.
Athugaðu bara eftirfarandi atriði eftir að grunnurinn er hannaður:
1. Hönnun primers nálægt 3′ endanum: Ef um er að ræða oligo dT primera fyrir cDNA fyrsta strengs nýmyndun, með hliðsjón af öfugum umritunarvirkni og RNA heilleika, þarf að hanna hönnuðu primerana nálægt 3′ endanum til að bæta mögnunarvirkni.Notaðu mynd til að útskýra sem hér segir (það er engin leið að skilja þetta):

Af hverju ætti að hanna primera nálægt 3′ endanum, það má ekki vera satt
2. TM gildi: Tm gildið er við 55-65°C (vegna þess að exonuclease virknin er mest við 60°C), og GC innihaldið er 40%-60%.
3. BLAST: Til að forðast ósértæka mögnun á erfðamenginu verður að nota Blast til viðbótarsannprófunar.

MIQE(7)—qPCR ferli

1. qPCR sett
Samkvæmt kröfum MIQE verðum við að lýsa skýrt heildarviðbragðsskilyrðum í greininni, þar á meðal uppsetningu PCR hvarfkerfisins, hvaða sett er notað, hver er framleiðandi, hversu stórt er hvarfkerfið, hvort litunaraðferðin eða rannsakaaðferðin er notuð, PCR forritastillingar.Gamlir ökumenn munu örugglega komast að því að svo framarlega sem settið er valið eru ofangreindar upplýsingar í grundvallaratriðum ákvarðaðar.
Sem stendur er framleiðsla og framleiðsla á flúrljómandi magnbundnum PCR settum mjög þroskuð tækni.Svo lengi sem þú velur ekki mjög slæma framleiðendur eru líkurnar á vandamálum ekki miklar, en við viljum samt deila með þér nokkrum atriðum:
Hot-start Taq ensím:Mikilvægasti hluti PCR er Taq ensímið með heitbyrjun.Hot-start ensímin á markaðnum eru almennt skipt í tvær tegundir, önnur er efnafræðilega breytt heitbyrjun ensím (þú getur ímyndað þér það sem paraffíninnfellingu) og hin er er heitstartensím til mótefnabreytinga (mótefnavaka-mótefnabinding).Efnabreyting er snemmbúin leið til að koma ensímum í gang.Þegar ákveðnu hitastigi er náð losar ensímið virkni sína.Mótefnabreytta hot-start ensímið notar líffræðilegar aðferðir til að hindra virkni ensímsins.Þegar ákveðnu hitastigi er náð verður mótefnið afeðlað og óvirkt sem prótein og ensímvirknin virkjuð.

Hins vegar, hvaða gagn er af þessu?Þetta er raunin, losunarvirkni mótefnabreyttra ensíma er hraðari en efnabreyttra ensíma, þannig að hvað varðar næmni hafa mótefnabreytt ensím smá yfirburði, þannig að í rauninni eru engin efnabreytt ensím í pökkunum á markaðnum.Ef svo er, þá er tækni þessa framleiðanda enn föst á tímum þúsaldar.
Magnesíumjón styrkur:Magnesíumjónastyrkur er mjög mikilvægur í PCR viðbrögðum.Viðeigandi magnesíumjónastyrkur getur stuðlað að losun Taq ensímvirkni.Ef styrkurinn er of lágur mun ensímvirknin minnka verulega;ef styrkurinn er of hár mun ensímhvataða ósértæka mögnunin aukast.Styrkur magnesíumjóna mun einnig hafa áhrif á annealing primers, bræðsluhita sniðmátsins og PCR afurða og hafa þar með áhrif á afrakstur mögnuðra brota.Styrkur magnesíumjóna er almennt stjórnaður við 25mM.Auðvitað, fyrir gott sett, verður styrkur magnesíumjóna að vera vel stjórnaður.Sumir kaupmenn bæta magnesíumjón klóbindandi efni við hvarfefnið, sem getur náð áhrifum sjálfvirkrar aðlögunar á magnesíumjónastyrk.
Styrkur flúrljómandi litarefnis:Flúrljómandi litarefni, sem er SYBR-grænn sem við notum venjulega, myndar aðallega flúrljómun með því að bindast við minni gróp tvíþátta DNA, vegna þess að binding litarins við tvíþátta DNA er ósértæk, það er að segja svo framarlega sem tvíþátta DNA er sameinað því, getur flúrljómun átt sér stað, þannig að primer-dimers sameinast frummerkjasniðmát og DNA-merkjasniðmát í kerfinu.
PS: Vegna ljósnæmra eiginleika þess eru vörur á markaðnum almennt pakkaðar í brúnt ógegnsætt skilvindurör (eins og sýnt er á myndinni hér að neðan).Hins vegar mun þetta lenda í vandræðum.Erfitt er að sjá hvort vökvinn sogast við sýnatöku.Að þessu leyti er Qingke örugglega mest notendavænt (eins og sést á myndinni hér að neðan) og gegnsæju rörinu er pakkað í ógegnsæjan blikkpoka.Settu það síðan í blikkpoka, að teknu tilliti til þæginda þess að forðast ljós og sýnatöku.Þú verður að velja rétt vörunúmer.TSE204 er frábær hagkvæm tilvera, sem fær mig til að vilja planta gras.

Styrkur flúrljómandi litarefnisins er einnig mjög mikilvægur.Ef styrkurinn er of lágur mun mögnunarferillinn ekki fara upp á seinna stigi og er ekki fullkominn;ef styrkurinn er of hár mun það valda hávaðatruflunum.Þar sem flúrljómandi magn PCR fer aðallega eftir CT gildi, ef styrkur flúrljómandi litarefnisins er ekki stilltur rétt, er lágpunkturinn betri en hápunkturinn.Auðvitað er viðeigandi litarstyrkur bestur.

ROX: ROX litarefni eru notuð til að leiðrétta fyrir villum í flúrljómun merkja vel til brunna.Sumir framleiðendur hljóðfæra krefjast kvörðunar á meðan aðrir gera það ekki.Til dæmis, notkun á rauntíma PCR mögnunartækinu frá Thermo Fisher Scientific krefst venjulega kvörðunar, þar á meðal 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, o.s.frv. Almennar leiðbeiningar settsins munu lýsa því.
Foregene's qPCR Mix inniheldur einnig ROX litarefni sem er þægilegt til notkunar í ýmsum gerðum.

Rauntíma PCR Kit-Taqman

Veik vetnistengi meðferð: Meðferð á veikum vetnistengi er tiltölulega tæknilegt mál.Ekkert hefur lesið handbækur margra setta, en enginn þeirra nefndi þetta efni.Reyndar er það svo mikilvægt.Samsetning basa fer aðallega eftir styrk vetnistengja.Sterk vetnistengi eru eðlileg mögnun og veik vetnistengi leiða til ósértækrar mögnunar.Ef ekki er hægt að útrýma veikum vetnistengi vel er ekki hægt að komast hjá ósértækri mögnun.Innan sviðs höfundar hafa aðeins örfá fyrirtæki tekið eftir þessu vandamáli.Þegar þú kaupir settið geturðu vísað til þess hvort þú hafir íhugað lausn í þessum efnum fyrir settið sem þú vilt velja.

Hvarfmagn: 20-50ul kerfið er oftar notað og minna magn er líklegt til að valda villum.Almennt séð munu leiðbeiningar settsins mæla með notkun PCR hvarfmagns.Ekki vera klár og nota minna magn til að spara kostnað.markmiðið um.Rúmmálið sem kaupmenn mæla með hefur í raun verið prófað og það getur verið að þeir geti ekki leyst vandamálið vegna villna sem orsakast af litlu magni.
2. Framleiðandi og vörunúmer slönguplötunnar
Allir þekkja meginregluna um flúrljómandi magn PCR.Flúrljómunarsöfnun fer aðallega fram í gegnum PCR slöngulok.Þegar þú velur PCR rekstrarvörur skaltu gæta að tveimur atriðum: Góð ljósflutningur og hentugur fyrir tækið.Almennt séð eru plötur og rör almennra vörumerkja í lagi, en þú verður að velja vandlega hvað varðar aðlögun, annars geturðu ekki notað hljóðfærið.

4. Þekking á hæsta stigi

MIQE (8)—qPCR staðfesting
Þetta er forgangsverkefni qPCR!Svo margar hetjur hafa fallið í sandinn hér.Auðvitað er líka mögulegt að þú sért heppinn og genin sem þú rannsakaðir eru einföld, svo þú svífur í gegnum íshellinn með vindinum.Sannprófunarupplýsingunum um qPCR er ætlað að prófa áreiðanleika gagnanna.Við skráum nauðsynlegar sannprófunarupplýsingar sem hér segir:

1.Specificity próf
Sérhæfni markgenamögnunar er prófuð með því að athuga hvort rafdráttarmyndin sé eitt band;raðsannprófun;bræðsluferill til að sjá hvort toppkortið sé eitt;ensímmeltunarsannprófun og aðrar aðferðir.
Hér leggjum við áherslu á thann greining á ósértækri mögnun með bræðsluferlum.Almennt talað, þegar við hönnum grunna, þarf að stærð vörubrotsins sé á bilinu 80-200bp, sem gerir bræðsluhitastig PCR vörunnar á bilinu 80-85 °C.Þess vegna, ef það eru ýmsir toppar, verða að vera aðrar ósértækar mögnunarafurðir;ef toppurinn virðist undir 80°C er hann almennt talinn vera primer dimer;ef toppurinn kemur fram yfir 85°C er almennt talið að um sé að ræða DNA mengun eða meira Ósértæk mögnun stórra brota.
Athugið: Stundum er aðeins einn toppur við 80°C.Á þessari stundu verður að fylgja þessari hugmynd.Líklegt er að mögnunarniðurstöðurnar séu allar primer dimerar.

Venjulegur bræðsluferill (einn toppur án ósértækrar mögnunar)

Vandasamur bræðsluferill (ósértæk mögnun á fölskum toppum)
【Tilviksgreining】

Það er aðal toppur, en primer dimer er alvarlegur
Einstaklingsbræðsluferillinn á myndinni hér að neðan getur auðveldlega blekkt augun þín, heldur að þetta sé fullkomin tilraun, en niðurstaðan er algjörlega röng.Á þessum tíma verðum við að skoða bræðsluhitastigið.Hámarkshiti er undir 80°C, sem er algjörlega primer-dimer.

Ekkert markbrot, allir primer dimerar
Hér getur bróðir minn ekki hætt.Myndin hér að neðan er mynd sem tekin var með farsíma sem skíthæll sendi mér.Hvarfefnin sem hann notaði eru öll algeng vörumerki í greininni.Hann breytti úr einu T-forskeyti vörumerki í annað T-forskeyti vörumerki.Ég held að þú hafir nú þegar giskað á það.Skíturinn hrópaði til mín: „Hvarfefnið sem notað var á fyrstu myndinni er of gott og toppurinn er einn.Seinna, eftir að hafa notað hvarfefnið sem þú mæltir með, verður það eins og önnur myndin, með blönduðum toppum.Þú hefur gert mig vansælan.“
Aðskildu línuritin tvö.Við fyrstu sýn hefur annar einn tind en hinn með tvöfaldan tind.Vitleysa, einn toppur er auðvitað fínn.Er það satt?
Verra en Dou E, ef ég set myndirnar tvær á myndinni hér að neðan, þá skilurðu strax.Reyndar lömumst við auðveldlega af svona myndum.Eftir nákvæma greiningu komumst við að því að: toppurinn á fyrstu myndinni er við 75°C, sem er algjörlega primer dimer;toppurinn á annarri myndinni birtist við 75°C og 82°C, að minnsta kosti eru það Varan birtist.

Myndir af endurgjöf frá nemendum
Svo grundvallarvandamálið er ekki vandamál hvarfefna, heldur vandamálið við grunnhönnun.Á sama tíma sannar það líka að sum stór vörumerki eru ekki af járngæði og það sannar líka það sem bróðir minn sagði áður: Það er ekki hvarfefnismerkið sem styður grein þína.Það er greinin þín sem ýtti undir vörumerki hvarfefna.Ímyndaðu þér bara, ef skíthællinn breytti ekki hvarfefnum, yrðu röng gögn send í dagbókina og það sem myndi gerast væri harmleikur.
2. Ct gildi auðstýringar
Ekki útskýra, ef eyðueftirlitið hefur Ct gildi, er það ekki mengun?Hins vegar þarftu enn að skilja hvaða auðstýring hefur Ct gildi.Ef það er NTC þýðir það að það er erlent DNA eins og hvarfefnismengun.Ef það er NRT þýðir það að útdregið RNA er með DNA mengun.
3. Standard ferill
Að meðtöldum halla og útreikningsformúlu er hægt að reikna PCR skilvirkni með formúlunni.Fullkomin tilraun krefst þess að halli staðalferilsins nálgist 3,32 og R² nálgist 0,9999.
4. Línulegt hreyfisvið
Hreyfisvið hvarfsins er línulegt.Samkvæmt sniðmátinu sem notað er til að búa til staðlaða ferilinn, ætti kraftasviðið að innihalda að minnsta kosti 5 styrkleikahalla og gaum að breytingum á Ct-gildum við mikla styrkleikahalla og lága styrkleikahalla.
5. Uppgötvunarnákvæmni
Breytingar á niðurstöðum qPCR, það er léleg endurtekningarhæfni, það er léleg nákvæmni, stafar af mörgum þáttum, þar á meðal hitastigi, styrk og virkni.qPCR nákvæmni verður almennt minna stjórnanleg þar sem afritafjöldi minnkar.Helst innan tilraunabreytinga ætti þessi tæknilega breytileiki að vera aðgreindur frá líffræðilegum breytileika og líffræðilegar endurtekningar geta beint fjallað um tölfræðilegan mun á qPCR niðurstöðum milli hópa eða meðferða.Sérstaklega fyrir greiningargreiningar þarf að tilkynna um bestu nákvæmni milli greiningar (endurtekningarhæfni) milli staða og rekstraraðila.
6. Uppgötvun skilvirkni og LOD (í multiplex qPCR)
LOD er ​​lægsti styrkur 95% jákvæðra sýna sem greindust.Með öðrum orðum, styrkur LOD sem er í setti markgenafrita ætti ekki að fara yfir 5% af viðbrögðum sem misheppnuðust.Þegar multiplex qPCR greiningu er gerð, sérstaklega fyrir samtímis uppgötvun á punktstökkbreytingum eða fjölbreytileika, þarf multiplex qPCR að gefa vísbendingar um að nákvæmni margra markbúta sé ekki í hættu í sömu túpunni, marggreining og skynjun í einni slöngu Skilvirkni og LOD ættu að vera þau sömu.Sérstaklega þegar markgen í mikilli styrkleika og markgen í lágum styrk eru mögnuð samtímis, verður að huga að þessu vandamáli.
Vandamál og lausnirAlmennt séð snúa vandamálin sem oft koma upp í qPCR kembiforritum á eftirfarandi þætti:
·ósértæk mögnun
·Erfitt val á primerstyrk og vandræði með primer-dimers
·Glöðuhitastigið er ónákvæmt
· Önnur uppbygging hefur áhrif á mögnunarvirkni
ósértæk mögnun
ósértæk mögnuná sér stað er almennt íhugað hvort grunnhönnunin henti ekki, en ef þú ert ekki að flýta þér að skipta um grunninn geturðu prófað eftirfarandi aðferðir fyrst (meginreglan fylgir líka):
· Auka hitastig glæðingar – reyndu að gera veik vetnistengi ófær um að viðhalda;
· Stytta glæðingar- og lengingartíma - minnka líkurnar á veikum vetnistengi;
· Dragðu úr þéttni grunns – minnka líkurnar á bindingu óþarfa grunna og svæðis sem ekki eru markhópar;
Lítil mögnunarvirkni
Hið gagnstæða ástand við ósértæka mögnun – lítil mögnunarvirkni og ráðstafanir til að takast á við litla mögnunarnýtingu eru einmitt hið gagnstæða:
· Lengja glæðingar- og lengingartímann;
· Breyttu í þriggja þrepa PCR og minnkaðu glæðuhitastigið;
· Auka grunnstyrkinn;
Ps: Margir framhaldsnemar fæddir á tíunda áratugnum eru ekki tilbúnir að læra hvernig á að kemba tilraunir og vona að settið geti leyst vandann alveg (ef þú vilt fara til hvarfefnafyrirtækis til að gera rannsóknir og þróun eftir útskrift), reyndar hugsa hvarfefnisframleiðendurnir líka á þennan hátt, ég vona að það sé fífl. frásogsþættir.Til að leysa vandamálið auðveldlega þurfa heimskingjar enn að lesa kynninguna á hvarfefnafyrirtækinu til að sjá hvort það sé þáttur sem gleypir veik vetnistengi.
Erfitt val á primerstyrk og vandræði með primer-dimers
Aðferð 1: Almennt séð hafa leiðbeiningar settsins fyrir qPCR ráðlögð kerfi og ráðlagðan grunnstyrk.
Aðferð 2: Villuleit með því að stilla grunnstyrksstigann.Myndinni hér að neðan er stolið frá fyrirtæki til að sýna.Myndin hér að neðan sýnir megindlegar flúrljómunarniðurstöður sem gerðar eru með þremur grunnstyrkstökkum (100nM, 250nM, 500nM) og fjórum sniðmátstyrkstökkum (0,1ng, 1ng, 10ng, 100ng).Ct gildi tilraunaniðurstaðna er teiknað sem hér segir:

Val á grunnstyrk Setjið hvern grunnstyrk saman í línu sem hér segir:

Val á grunnstyrk er augljóst, línulegt samband grunnstyrks 100nM og 250nM er betra og línulegt samband grunnstyrks 500nM er tiltölulega lélegt.Í 100nM og 250nM er Ct gildið 250nM tiltölulega lítið, þannig að ákjósanlegur grunnstyrkur er 250nM.Almennt má sjá alvarlega primer-dimera í bræðsluferlinum.Hvað ef hönnuðu primerarnir geta ekki forðast primer-dimera?
Aðferð 3: Dragðu úr magni grunna og aukið hitunarhitastig (ekki þarf að útskýra).
Reynslugildi glæðingarhitans er 60°C.Ef þú ert ekki viss, hvernig á að velja hentugra glæðuhitastig?Svarið er það sama og val á grunnstyrk -hallapróf.Taktu mynd frá Bio-rad fyrirtækinu til að sýna vandamálið.Fyrir mögnun á tilteknu markbúti, stilltu átta hitastigshalla, hver með þremur endurtekningum, og mögnunarferillinn sem fæst er sem hér segir:

val hitastigs við glæðingu:
·70°C, 69°C—Í grundvallaratriðum er ekki hægt að sameina primerana, þannig að það er engin mögnun.
·67,3°C – Það er lítil mögnun í upphafi og Ct gildið er tiltölulega mikið.
·64,5°C——Ct gildið lækkar.
·Við 60,7°C, 58,0°C, 56,2°C og 55,0°C höfðu Ct gildin í grundvallaratriðum tilhneigingu til að vera stöðug, en lokaflúrljómunargildin voru önnur.
Hvernig á að velja?Meginregla: Fyrsta meginreglan er hærra Ct gildi.Fyrir sama Ct gildi, veldu hærra glæðingarhitastig til að forðast dimmerun og ósértæka mögnun.Þó að það sé hærra flúrljómunargildi við 55°C, þá geta verið dimerar eða ósértæk mögnun í því.
En ef þú ert jafn klár og þú munt þú örugglega hugsa: Rökfræðilega séð, ef PCR viðbrögðin eru mjög sértæk, svo lengi sem styrkur grunnsins fer yfir lágmarkskröfu, ættu háir og lágir punktar að hafa engin áhrif, rétt eins og flúrljómandi litarefni og dNTP.Reyndar, svo framarlega sem glæðingarhitastigið er fínstillt á réttan hátt, verða áhrif grunnstyrks á Ct gildi náttúrulega lágmarkað.

Hreinsunarhitastigið er fínstillt á réttan hátt og áhrif grunnstyrks á CT verða lágmarkuð
Auka uppbygging hefur áhrif á mögnunarvirkni
Tökum myndina úr Bio-rad til að sýna vandamálið.Það hannar einnig hitastig til að magna upp gen með aukabyggingu.

Secondary uppbygging kemur fram
Það má sjá að þegar hitastigið minnkar byrja vörur að birtast og Ct gildið færist áfram, nær lágmarksgildinu við 60,7°C og síðan þegar hitastigið minnkar verður Ct gildið stærra.Hins vegar, þegar hitastigið eykst, opnast aukabyggingin og mögnunarvirknin eykst.Eftir að hafa náð ákveðnu hitastigi getur aukning hitastigsins ekki bætt mögnunarvirknina.Vegna þess að ekki er hægt að sameina primerana stöðugt á þessum tíma.Þess vegna,leitaðu að hitastigi með lægsta Ct gildi, sem er besti hitastigið til að magna upp aukabyggingarsniðmátið!Auðvitað verða klárir fífl að vita að ef það er ekki nauðsynlegt er best að skipta um grunn og forðast aukabyggingarsvæðið.
5. Umsóknarstig
MIQE—Gagnagreining

Gagnagreiningin er aðallega gefin með flúrljómandi magn PCR tækinu.Í fyrri grein hefur mikil gagnagreiningarvinna verið unnin, eins og blankstýringin sem hefur verið útskýrð í hönnun tilraunarinnar.Innri viðmiðunargenin, endurtekningartölur o.s.frv. hafa verið skýrðar., hér útskýrum við aðallega notkun qPCR.
qPCR er mikið notað og tilraunasannprófun og kjarnsýrugreining eru algengustu aðstæðurnar.
alger magngreining
Log (upphafsstyrkur) hefur línulegt samband við fjölda lota.Hægt er að draga staðlaða feril úr staðli með þekkt upphafsnúmer, það er hægt að fá línulegt samband mögnunarhvarfsins.Samkvæmt Ct gildi sýnisins er hægt að reikna styrkinn í sýninu.Magn sniðmáta sem á að hafa með.

Alger magnreikningsaðferð
Alger magngreining verður að byggjast á stöðluðu ferlinum.Til að búa til staðlaðan feril þarf staðal.Venjulega er staðallinn plasmíð sem fæst með því að klóna markgenið.Af hverju er það plasmíð?Vegna þess að hringlaga plasmíð DNA er stöðugasta.Þynnið staðlaða vöruna í 5 til 6 halla í samræmi við tvöföldunarhlutfallið (10-föld þynning) og gaum að einsleitni við þynningu.Láttu Ct gildið falla á milli 15-30.

Hefðbundinn undirbúningur
Á sama tíma ætti einnig að þynna sýnið sem á að prófa í samræmi við það (mundu þynningarstuðulinn) og Ct gildið ætti einnig að vera á milli 15-30.Stöðluð vara + sýnishornið sem á að prófa eru sett á vélina saman.Eftir keyrsluna var gerð staðalferill með staðlaða efninu og sýnin sem á að prófa voru færð inn í staðalferilinn til að reikna út styrkinn.
Lifrarbólgu B veiru HBV magngreining er dæmigerð alger magngreining, sem getur reiknað út fjölda afrita veirunnar í 1 ml af blóði.
Útreikningur á afritsnúmeri
Styrkur sýnis sem á að prófa (ng/ul) = OD260 × 50g/ml × þynningarstuðull
Mólþungi sýnis = fjöldi basa × 324
Afritsnúmer sýnisins sem á að prófa (afrit/ul) = styrkur sýnisins sem á að prófa / mólþyngd sýnisins × 6 × 1014

Útreikningsaðferð afritsnúmers

Ofangreint er útreikningsaðferðin til að ákvarða magnið.Þetta er stærðfræðivandamál sem hægt er að leysa eftir útskrift úr unglingaskóla og stærðfræðivandamál eru almennt leyst með tölvum.Ef þú skilur ekki geturðu komið til að hafa samskipti.
hlutfallsleg magngreining
Hlutfallsleg magngreining er aðallega notuð í vísindarannsóknum.Hversu margar veirur eru í 1 ml af blóði, og það er DNA veira, þetta er tiltölulega ákvarðandi atburður: hægt er að ákvarða blóðmagnið og DNA veiran er tiltölulega stöðug.Hins vegar er erfitt fyrir okkur að bera saman fjölda umritunarafrita af ákveðnu geni í laufblaði, vegna þess að erfitt er að ákvarða stærð, þyngd og viðkvæmni laufblaðsins, magn útdregna RNA er erfitt að ákvarða og einnig er erfitt að ákvarða skilvirkni öfugumritunar, það er að segja, hvaða skref sem er getur valdið því að tilraunagögnin innihaldi galla og er ekki hægt að nota.
Þess vegna verður hlutfallsleg magngreining að kynna frumefni:innra viðmiðunargenið.
Með öðrum orðum, hlutfallsleg magngreining er í raun samanburður á markgeninu og innra viðmiðunargeninu.Samanborið í sama vef og sömu frumu eru áhrif sýnisstærðar, RNA-útdráttarmagns, gagnvirkrar umritunar skilvirkni og PCR skilvirkni tiltölulega lítil.Vegna lítillar sýnastærðar voru bæði innri viðmiðunargen og markgen tiltölulega minni.Þess vegna höfum við áður lagt áherslu á einsleitni og stöðugleika.
Innri viðmiðunargen eru almenntheimilishaldsgen(house-keeping gen), sem vísa til flokks gena sem eru stöðugt tjáð í öllum frumum, og afurðir þeirra eru nauðsynlegar til að viðhalda grunnlífsstarfsemi frumna.
Ekki rugla þessu hugtaki saman.Húshaldsgen eru líffræðileg virknihugtök en innri viðmiðunargen eru tilraunatæknileg hugtök.Húshaldsgen þurfa að standast löggildingu áður en hægt er að velja þau sem innri viðmiðunargen.
Til dæmis völdum við nokkur heimilisgen á myndinni hér að neðan til að prófa tjáningarstig þeirra í mismunandi veffrumum og komumst að því að tjáningarmagn β-2-míkróglóbúlíns var talsvert frábrugðið hinum þremur genunum, svo ekki var hægt að nota þau sem innri viðmiðunargen.

Eftir að hafa skilið leiðréttingarvirkni innra viðmiðunargensins eru tvö reiknirit unnin vegna tilkomu innra viðmiðunargensins.
· tvöföld stöðluð ferilaðferð
·2 – △△Ct aðferð (CT gildi samanburðaraðferð)
Ef þú hefur áhuga á að rannsaka tegundir og starfsemi gena, vinsamlegast gefðu upp rannsóknirnar á reikniritum og notaðu formúlur beint, eða notaðu vélar beint;ef þú ert beinn gaur í stærðfræði og verkfræði, vinsamlegast ekki hika við.
tvöfaldur staðall ferill aðferð
Mældu markgenið og heimilisgenið í viðmiðunarsýninu og sýninu sem á að prófa í gegnum staðlaða ferilinn og reiknaðu síðan hlutfallslegt gildi samkvæmt útreikningsformúlunni, sem er hlutfallslegt tjáningarstig.
Kostir: einföld greining, tiltölulega einföld tilraunahagræðing
Ókostur: Fyrir hvert gen verður hver tilraunalota að búa til staðlaðan feril
Notkun: Ein af tveimur algengustu og viðurkennustu hlutfallslegu megindlegum aðferðum við rannsókn á stjórnun genatjáningar
Formúlan er sem hér segir:

Dæmi eru sem hér segir:

Reiknaðu hlutfallslegt magn út frá magnbundinni niðurstöðu
2 – △△Ct aðferð (CT gildi samanburðaraðferð)

Kostir: Engin þörf á að búa til staðlaðan feril
Ókostir: Gert er ráð fyrir að mögnunarnýtingin sé nálægt 100%;staðalfrávikið er < 5% og gert er ráð fyrir að staðalferillinn og skilvirknin milli hverrar mögnunar sé í samræmi;hagræðing tilraunaaðstæðna er flóknari.
Notkun: Ein af tveimur algengustu og viðurkennustu hlutfallslegu megindlegum aðferðum við rannsókn á stjórnun genatjáningar

Auðvitað er mögnunarnýtingin venjulega ómöguleg að vera fullkomlega 1. Leiðréttingaraðferð: Ef við vitum að markgenið og viðmiðunargenið hafa sömu mögnunarnýtingu, en mögnunarvirknin er ekki jöfn 1, þá er hægt að leiðrétta 2－△△Ct sem: (1+E )－△△Ct, þá er t.d. hægt að leiðrétta mögnunarvirknina í 5, ef 0 er hægt að leiðrétta 5. .95－△△Ct
Hingað til hefur innihaldinu um flúrljómandi magn PCR lokið.