Leiðbeiningar um vandamálagreiningu

Eftirfarandi greining á vandamálum sem þú gætir lent í íPlant SamtalsRNA extraction will help you with your experiments. In addition, for other experimental or technical problems in addition to operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. If you have any needs, please contact us at: 028-83360257 or E-mali : Tech@foregene.com.

Snúningssúlan er stífluð

Stífla á snúningssúlunni mun valda því að RNA-afraksturinn minnkar eða jafnvel ekki hægt að hreinsa hana til að fá RNA og gæði RNA sem fæst verða lítil.

Algeng orsök greining:

1. Sýnið er ekki alveg brotið.

Ófullkomin sundrun sýnis getur hindrað DNA-hreinsunarsúluna, sem getur einnig haft áhrif á RNA-afrakstur og gæði.Við mælum með því að þegar sýnisbrot eru framkvæmd, sé fljótt malað í nægilegu magni af fljótandi köfnunarefni til að brjóta upp vefi eins og frumuveggi og frumuhimnur sýnanna eins mikið og mögulegt er.Fyrir plöntusýni af pólýfenól fjölsykrum mælum við með að þú notir Plant Total RNA Isolation Kit Plus.

2.Sogðu upp DNA-hreinsunarsúlu einangraða flotinu, sogðu upp mögulega frumukúlu.

Uppsogð frumukilla getur stíflað RNA-einungis súluna við RNA aðsogsaðferðir (sjá skref 5 í aðferð, skref 6 í fjölsykru fjölfenól aðferð).Við mælum með því að gæta þurfi varúðar við að soga þessu flotvatni til að forðast að frumurusl sé sogað upp.

3. Upphafsmagn sýnis er of stórt.

Of mikil sýnisnotkun mun leiða til ófullkominnar sýnisbrots eða ófullkominnar leysingar frumna með Buffer PRL1 eða Buffer PSL1, sem leiðir til stíflaðrar hreinsunarsúlu fyrir hreinsunaraðgerðir.Plant Total RNA Isolation Kit hefur upphaflega hámark 50 mg fyrir hverja einustu hreinsun á reknu sýni.Fyrir plöntusýni af pólýfenól fjölsykrum mælum við með að þú prófir Plant Total RNA Isolation Kit Plus.

4. Hitastig skilvindunnar er of lágt.

Heil RNA einangrun og hreinsun, nema fyrir fljótandi köfnunarefnisröskun á sýnisvef, öll skref eru framkvæmd við stofuhita (20-25 °C).Sumar lághitaskilvindur hafa hitastig undir 20 °C, sem getur valdið stíflum í DNA-hreinsunarsúlunni og/eða RNA-eingöngu súlunni.Ef þetta gerist skal stilla skilvinduhitastigið á 20-25 °C og forhita lýsisblönduna og/eða bæta við etanólaðskilnaðarfljótandi vökva í 37 °C.

Ekkert RNA dregið út eða afrakstur RNA er lág

Það eru venjulega margir þættir sem hafa áhrif á skilvirkni endurheimtarinnar, svo sem: RNA innihald sýnis, vinnsluaðferð, skolunarrúmmál osfrv.

Greining á algengum orsökum eins og hér að neðan:

1. Ísbað eða skiljun við lágan hita (4°C) var framkvæmd meðan á aðgerðinni stóð.

Tillaga: Vinnið við stofuhita (15-25°C) í öllu ferlinu, ekki gera ísbað og miðflótta við lágan hita.

       2.RNA hefur verið brotið niður vegna óviðeigandi varðveislu sýnisins eða langtímavarðveislu sýnisins.

Tilmæli: Nýsöfnuð sýni ættu að vera fljótfryst í fljótandi köfnunarefni og síðan geymd við -80°C í langan tíma, forðast endurtekna frystingu og þíðingu sýna;eða drekka sýnin strax í RNA stabilizer RNAlater lausn (dýrasýni).

       3.Ófullnægjandi sundrun sýnis og leysis leiðir til stíflu á hreinsunarsúlunni.

Tillaga: Þegar vefurinn er malaður, vinsamlegast vertu viss um að vefurinn sé nægilega malaður og færðu hann fljótt yfir í fyrirfram tilbúinn Buffer PSL1 (staðfestu að réttu hlutfalli β-ME hafi verið bætt við, sjá skref 1 í aðferðinni).

4.Skolefninu var ranglega bætt við.

Tillaga: Gakktu úr skugga um að RNase-Free ddH₂O er dreypt í miðja hreinsunarsúluhimnu.

5. Rétt magn af algeru etanóli var ekki bætt við Buffer PSL2 eða Buffer PRW2.

Tillaga: Vinsamlegast fylgdu leiðbeiningunum, bættu réttu magni af algeru etanóli við Buffer PSL2 og Buffer PRW2 og blandaðu vel saman áður en settið er notað.

6. Magn vefjasýnis er óviðeigandi.

Tillaga: Notaðu 50 mg af vefjum fyrir hverja 500 μl af Buffer PSL1.Notkun of mikils vefja mun draga úr magni RNA sem er dregið út og hreinleiki RNA sem myndast mun einnig minnka.Við mælum eindregið með því að upphafsskammtur sýnis fari ekki yfir 50 mg fyrir hverja RNA-útdráttaraðgerð.

7. Óviðeigandi skolunarrúmmál eða ófullkomin skolun.

Tillaga: Rúmmál skolunar í hreinsunarsúlunni er 50-200 μl;ef skolunaráhrifin eru ekki fullnægjandi er mælt með því að lengja tímann við stofuhita eftir að búið er að forhita RNase-Free ddH₂O, eins og 5-10 mín.

8.Hreinsunarsúlan hefur etanólleifar eftir þvott með Buffer PRW2.

   Tillaga: Ef tóma rörið er skilið í skilvindu í 1 mín og það er enn etanól eftir eftir þvott í Buffer PRW2, getur þú aukið tíma skilvindu tóma rörsins í 2 mínútur, eða sett hreinsunarsúluna við stofuhita í 5 mínútur til að fjarlægja afgangs etanólið að fullu.

9. Settið var rangt notað.

   Tillaga: Fyrir plöntusýni af fjölfenólum fjölsykrum getur verið að notkun algengra setta eins og Plant Total RNA Isolation Kit gæti ekki fengið tilvalin RNA sýni.Við mælum með að þú notir Plant Total RNA IsolationKit Plus, sem er sérstaklega hannað fyrir fjölfenólísk fjölsykru plöntusýni.Sett sem er sérstaklega þróað til að vinna RNA úr fjölfenóli og fjölsykru plöntusýnum.

OD260/OD280 gildi er lágt

RNA skolun með ddH₂O og notað til að lesa litrófsmæla leiðir til lágs OD260/OD280 gildi.Við mælum með að nota 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 (frekar en RNase-Free ddH₂O til að skola út RNA) til að fá tiltölulega rétt OD260/OD280 gildi, sjá „RNA styrkleika- og hreinsunarprófanir“ á blaðsíðu 19.

Hreinsað RNA er brotið niður

Gæði hreinsaðs RNA eru tengd þáttum eins og varðveislu sýna, RNase mengun og meðferð.

Greining á algengum orsökum:

1.Vefjasýni voru ekki geymd í tæka tíð eftir söfnun.

    Tilmæli: Ef vefjasýnin eru ekki notuð í tæka tíð eftir söfnun, vinsamlegast geymdu þau strax í fljótandi köfnunarefni við lágan hita eða færðu þau strax yfir í -80°C til langtímageymslu eftir hraðfrystingu í fljótandi köfnunarefni, eða dýfðu sýnunum strax í RNA stabilizer RNAlater lausn (dýrasýni).Fyrir RNA útdrátt, reyndu að nota nýsöfnuð vefjasýni.

2.Endurtekin frysting og þíðing vefjasýna.

   Tillaga: Þegar vefjasýni eru geymd er best að skera þau í litla bita til varðveislu og taka hluta af þeim út þegar þau eru notuð til að forðast niðurbrot RNA sem stafar af endurtekinni frystingu og þíðingu sýna.

3.RNase er kynnt á skurðstofu eða ekki notaðir einnota hanska, grímur o.fl.

   Tillaga: Best er að framkvæma RNA útdráttartilraunir í aðskildum RNA-aðgerðum og skal þrífa rannsóknarstofuborðið fyrir tilraunina og nota einnota hanska og grímur meðan á tilrauninni stendur til að forðast niðurbrot RNA af völdum innleiðingar RNase í sem mestum mæli.

4.Hvarfefnið er mengað af RNase við notkun.

   Tillaga: Skiptu út fyrir nýja röð af heildar RNA útdráttarsettum úr plöntum fyrir tengdar tilraunir.

5. Skilvindurörin og pípettuoddarnir sem notaðir eru til að meðhöndla RNA eru mengaðir af RNase.

Tillaga: Gakktu úr skugga um að skilvindurörin, pípettuoddarnir, pípetturnar o.s.frv. sem notaðar eru við RNA-útdrátt séu öll RNase-frjáls.

Leiðbeiningarhandbækur:

Plant Total RNA Einangrunarsett Leiðbeiningarhandbók