1. Greindu frásog RNA lausnar
Frásog við 280, 320, 230 og 260 nm táknar gildi kjarnsýra, bakgrunns (grugga lausnar), saltstyrks og lífrænna efna eins og próteina, í sömu röð.Horfðu almennt aðeins á OD260/OD280 (hlutfall, R).Þegar 1,8~2,0 teljum við að hægt sé að þola mengun próteina eða annarra lífrænna efna í RNA, en það skal tekið fram að þegar Tris er notað sem stuðpúði til að greina gleypið getur R gildið verið hærra en 2 (almennt ætti það að vera <2,2).Þegar R<1,8 er mengun próteins eða annarra lífrænna efna í lausninni augljósari og hægt er að ákvarða örlög RNA í samræmi við þarfir.Þegar R>2.2 þýðir það að RNA hafi verið vatnsrofið í eina kjarnsýru.
2.Electrophoretic mynstur RNA
Almennt er náttúrulegt hlaup notað við RNA rafdrætti, en ef það er aðeins til að greina gæði RNA er eðlisvandi hlaup ekki nauðsynlegt og hægt er að nota venjulegt agarósa hlaup.Tilgangur rafdráttar er að greina heilleika 28S og 18S banda og hlutfall þeirra, eða heilleika mRNA stroku.Almennt séð, ef 28S og 18S böndin eru björt, skýr og skörp (miðað við að brúnir böndanna eru skýrar), og birta 28S er meira en tvöfalt meiri en 18S böndin, teljum við gæði RNA vera góð.
Ofangreind eru þær tvær aðferðir sem við notum almennt, en hvorug þessara tveggja aðferða getur sagt okkur greinilega hvort það er leifar af RNase í RNA lausninni.Ef það er mjög lítið magn af RNase í lausninni er erfitt fyrir okkur að greina það með ofangreindri aðferð, en flest síðari ensímhvörf fara fram við yfir 37 gráður og í langan tíma.Þannig, ef það er mjög lítið magn af RNase í RNA lausninni, þá verður mjög hentugt umhverfi og tími til að gegna hlutverki sínu í síðari tilraunum og tilraunin verður auðvitað köld á þessum tíma.Hér að neðan kynnum við aðferð sem getur staðfest hvort það sé leifar af RNase í RNA lausninni.
3. Hitaverndarpróf
Í samræmi við sýnisstyrkinn skaltu draga tvö 1000 ng RNA úr RNA lausninni og bæta því við 0,5 ml skilvinduglas og bæta við pH 7,0 Tris jafnalausn að heildarrúmmáli 10 ul og lokaðu síðan lokinu á rörinu.Settu einn þeirra í vatnsbað með stöðugu hitastigi við 70°C og haltu því heitu í 1 klst.Hinn hlutinn var geymdur í -20°C ísskáp í 1 klst.Þegar tíminn er liðinn skaltu fjarlægja tvö sýnin fyrir rafskaut.Eftir að rafhleðslunni er lokið skaltu bera saman rafskautsböndin af þeim tveimur.Ef böndin af þessu tvennu eru í samræmi eða hafa engan marktækan mun (að sjálfsögðu uppfylla böndin þeirra einnig skilyrðin í aðferð 2), þýðir það að það er engin leifar af RNase mengun í RNA lausninni og gæði RNA eru mjög góð.Þvert á móti, ef sýnið sem ræktað er við 70°C sýnir augljóst niðurbrot bendir það til þess að það sé RNase mengun í RNA lausninni.
2 Tilraunaaðferðir og tækni við RNA útdrátt
Vandamálin sem við lendum oft í þegar RNA er dregið út eru: (1) RNA uppskera er lág;(2) RNA hefur alvarlega saltmengun;(3) RNA hefur alvarlega lífræna leysimengun;(4) sýnishorn niðurbrot og önnur vandamál
1. Algengt notuð heildar RNA útdráttarhvarfefni
Gúanidínísóþíósýanataðferðin og Trizol aðferðin eru algengustu aðferðirnar til að draga heildar-RNA úr dýravef og dýrafrumum.Það er sérstaklega hentugur fyrir lítil sýni og vefi sem er sérstaklega erfitt að draga út, svo sem útdrátt á heildar-RNA úr kanínuhúð og bandvef dýra;auk þess er Trizol, sem almennt lýsishvarfefni, einnig hægt að nota til útdráttar á plöntuvef, bakteríum, sveppum og öðrum vefjum.Fyrir plöntuvef sem innihalda fjölsykrur og fjölfenól, eins og Camellia oleifera, telauf, repjufræ o.s.frv., er einnig hægt að nota CTAB aðferðina til að draga út heildar-RNA.
Sem hefðbundin aðferð er tvöfalda súluaðferðin einnig mjög vinsæl vegna venjulegs hitastigs, engin þörf á að bæta við RNase og öryggi - ekkert klóróform, fenól og önnur lífræn hvarfefni til útdráttar.(vörur sem mælt er með )
2. Útdráttur heildar-RNA úr dýravef
(1) Reyndu að velja ferskan vef, ef hann er ekki ferskur (helst innan þriggja mánaða - 80 ℃ kæliskápur eða frosinn í fljótandi köfnunarefni. Þegar vefja er skorið, ekki skera beint við stofuhita, vertu viss um að setja það á ísboxið, reyndu að forðast endurtekna frystingu og þíðingu.
(2) Notaðu hrein skæri og pincet til að skera lítið stykki af vefjum, reyndu að klippa miðhluta vefsins þegar sýnishornið er skorið, eða klipptu fyrst stóra vefjastykkið frá miðjunni og klipptu síðan sýnið í ferskum skurðarstöðu.Fjarlægða vefinn ætti að vera að fullu tættur, settu rifna vefinn í EP-hólk án RNase, bæta við lýsinu, rifna vefinn ætti að vera að fullu útsettur fyrir lýsinu og undirbúa einsleitun.
(3) Fyrir eðlilega vefi skaltu velja vefi á stærð við mungbauna (30-60 mg) til einsleitni.Ef vefirnir innihalda mikið magn af próteini, fitu eða þéttum trefjavef eins og lifur, skal auka eða minnka magn skorinna vefja á viðeigandi hátt (valfrjálst) Veldu 10~20 mg).
(4) Ef fiskvöðvar, rækjukjöt, marglyttur og aðrir vefir með mikið vatnsinnihald eru dregin út, ætti að auka magn sýnisins á viðeigandi hátt (ráðlagt 100-200 mg).
(5) Ef aðstæður leyfa er hægt að draga dýravefinn beint út eftir að hafa verið gerður einsleitur með vefjajafnara með hágangi, ef slíkur búnaður er ekki til.
(6) RNA sem fæst eftir lokaútdrátt skal setja strax á ísboxið til að draga úr niðurbroti RNA.
3. Dýrafruma RNA útdráttur
(1) Sviffrumur: skilið beint í skilvindu og fargið miðlinum, þvoið með dauðhreinsuðu PBS í 1-2 sinnum, blandið síðan með viðeigandi magni af PBS og bætið síðan við lysati til að lýsa.Ekki bæta lýsinu beint við útfelldar frumur eftir að vökvanum hefur verið hent alveg.Þetta mun valda því að histónpakkinn, sem losaður er eftir að lýsuðu frumurnar á ytra laginu, festist utan á útfelldu frumurnar og takmarkar þar með snertingu frumanna inni í kögglinum við lýsatið., sem leiðir til ófullkomins frumuleysis og minnkaðrar RNA-afraksturs.
(2) Frumur sem eru hálf viðloðandi eða ekki vel viðloðandi: Eftir að efnið hefur verið fargað, þvoið með PBS í 1-2 sinnum, gleypið síðan beint í sig viðeigandi magn af PBS og blásið í ræktunarskálina með pípettu eða byssu til að blása af frumunum og flytja þær yfir í RNA-fríar frumur.Bætið lýsinu við EP rör ensímsins til útdráttar.
(3) Viðloðandi frumur: þarf fyrst að melta með trypsíni, síðan safna í RNase-frí EP glös, skila í skilvindu til að fjarlægja flotið, þvo 1-2 sinnum með PBS til að fjarlægja umfram trypsín og blanda aftur með viðeigandi magni af PBS. Haltu síðan áfram að útdráttarþrepinu.
4. Plöntu RNA útdráttur
Plöntuvefur eru ríkur af fenólsamböndum, eða ríkur af fjölsykrum, eða innihalda óþekkt efri umbrotsefni, eða hafa mikla virkni RNase.Þessi efni eru þétt sameinuð RNA eftir frumugreiningu til að mynda óleysanlegar fléttur eða kvoðaútfellingar sem erfitt er að fjarlægja.Þess vegna, þegar við þykkjum plöntuvef, þurfum við að velja sett fyrir plöntur.Lysatið í settinu getur á áhrifaríkan hátt leyst vandamálin við að auðvelda oxun fjölfenóla og aðskilnað fjölsykruefnasambanda og kjarnsýra.
(Fyrir útdrátt fjölsykru pólýfenól plantna RNA, ráðlagðar vörur:
(1) Hýði, kvoða, fræ, lauf o.s.frv. plöntunnar ætti að vera að fullu malað í mortéli.Meðan á malaferlinu stendur ætti að fylla á fljótandi köfnunarefni í tíma til að forðast að sýnið bræði.Bæta skal malaða sýninu fljótt við lýsið og hrista það til að forðast niðurbrot RNA.
(2) Fyrir trefjarík sýni eins og hrísgrjón og hveitilauf ætti að draga úr magni útdráttar á viðeigandi hátt, annars verður vefjasmölun og leysing ekki lokið, sem leiðir til lítillar afraksturs af útdregnu RNA.
(3) Fyrir plöntuvef með mikið vatnsinnihald, eins og granatepli ávexti, vatnsmelónuávexti, ferskjuávexti o.s.frv., ætti að auka sýnishornið á viðeigandi hátt (100-200 mg er valfrjálst).
(4) Plöntuvef, eins og plöntulauf, rhizomes, harðir ávextir og önnur efni, er almennt mælt með því að nota fljótandi köfnunarefni til að steypa innihaldsefnin vandlega í steypuhræra og halda síðan áfram í útdráttarþrepið.Hefðbundin vefjajafnari getur ekki verið árangursrík við einsleitni plöntuvefja og er almennt ekki mælt með þeim.
5. Varúðarráðstafanir við RNA útdrátt
(1) Vefjasýni ættu að vera eins fersk og hægt er til að forðast endurtekna frystingu og þíðingu.
(2) Vefurinn ætti að vera að fullu malaður við útdrátt og magn vefja ætti ekki að vera of lítið, hvað þá of mikið.
(3) Gefa skal nægan ræktunartíma eftir að lýsinu hefur verið bætt við til að rjúfa sýnið að fullu.
(4) Þegar Trizol aðferðin er notuð til útdráttar, er meginreglan um að gleypa ofanvatnið eftir lagskiptingu "kjósið að anda að sér minna en anda að sér meira", og má ekki draga út í miðlagið, annars mun það valda alvarlegri erfðafræðilegri DNA mengun.
(5) Við þvott ætti þvottavökvinn að síast að fullu um rörvegginn til að tryggja ítarlega þvott.
(6) Fyrir súluútdráttaraðferðina, auk þess að losa súluna eftir þvott, skal aðsogssúlan einnig sett á ofurhreinan bekk og blása í 5-10 mínútur til að gufa upp lífræna leysirinn að fullu þar til hún þornar.
(7) Við síðustu skolun á súluaðferðinni, eftir að DEPC vatni hefur verið bætt við, ætti að rækta það í 3-5 mínútur, eða hita DEPC vatnið í 60°C fyrirfram til að auka skolunarafraksturinn.Í hefðbundinni Trizol klofnun og ísóprópanól útfellingaraðferð er endanlegt RNA leyst upp í DEPC vatni, þannig að gefa ætti viðeigandi tíma til upplausnar og botn skilvindurörsins ætti að blása stöðugt með pípettuodda.
3 Tþrjár orsakir og lausnir fyrir lágum RNA styrk/lélegum gæðum
1. Afraksturinn er of lágur
Útdráttarsýnið er of lágt, heildarmagnið er ófullnægjandi eða útdráttarsýnið er of mikið og lýsingin er ekki lokið;nota skal vefinn eða frumurnar af viðeigandi gæðum til útdráttar, formeðferð sýnisins verður að fara vel fram og lýsingin ætti að vera nægjanleg.
2. Erfðamengi leifar
Við útdrátt með Trizol aðferð, þegar flotið sogast inn í miðlagið eftir lagskiptingu, verður alvarleg mengun í erfðamengi;Gæta skal sérstakrar varúðar við lagningu til að forðast að sogast inn í miðlagið.Ef súluaðferðin er notuð til útdráttar er hægt að velja sett sem inniheldur DNase I til útdráttar.Kjarnsýran sem aðsogast á himnuna er beint melt með DNase I, sem getur dregið mjög úr DNA leifum.
3. RNA niðurbrot
Það getur verið niðurbrot útdregna sýnisins sjálfs eða niðurbrotið sem stafar af útdráttarferlinu;Eins og kostur er skal nota fersk sýni til RNA-útdráttar og geyma sýnin sem safnað er í fljótandi köfnunarefni eða -80°C kæli tímanlega og forðast skal endurtekna frystingu og þíðingu.Nota skal RNase/DNase-lausar odd, skilvindurör og önnur efni í RNA-útdráttarferlinu.Útdráttarferlið ætti að vera eins hratt og mögulegt er.Útdregið RNA ætti að setja á ísbox og geymt við -80 í tíma.Ef greina þarf útdregna RNA-efnið með gelraskafti skal gera rafskaut strax eftir útdrátt og skipta út rafdrættisbuffinu fyrir nýútbúið.
4. Salt og lífræn leysileifar
Útdráttarhvarfefnin innihalda fenól og gúanidínsölt og þvottalausnin inniheldur etanól.Í útdráttarferlinu var lýsatið ekki alveg frásogast og hent og þvottalausnin var ekki alveg þurrkuð.Afgangssölt og lífræn leysiefni eru skaðleg síðari öfugumritun og PCR.Mismunandi gráður hömlunar, þannig að vefjalýsatið ætti að vera að fullu fjarlægt meðan á útdráttarferlinu stendur og þvotturinn ætti að vera nægjanlegur svo hægt sé að þvo nærliggjandi veggi rörsins.Að auki er rörið tæmt og blásið er nauðsynlegt skref, sem mun draga enn frekar úr leifum lífrænna efna.
Fyrir frekari upplýsingar um RNA útdrátt, vinsamlegast fylgdu vefsíðu okkar:
www.foreivd.com fyrir frekari upplýsingar.
Pósttími: Des-01-2022
