Engin mögnunarmerki

1. Taq DNA pólýmerasinn í settinu missir virkni sína vegna óviðeigandi geymslu eða útrunnsins á settinu.
Ráðlegging: Staðfestu geymsluskilyrði settsins;bættu aftur viðeigandi magni af Taq DNA pólýmerasa við PCR kerfið eða keyptu nýtt rauntíma PCR Kit fyrir tengdar tilraunir.

2.Það er mikið af hemlum á Taq DNA pólýmerasa í DNA sniðmátinu.
Tillaga: Endurhreinsaðu sniðmátið eða minnkaðu magn sniðmátsins sem notað er.

3.Mg2+ styrkurinn hentar ekki.
Ráðlegging: Mg2+ styrkur 2× Real PCR Mix sem við útvegum er 3,5mM.Hins vegar, fyrir suma sérstaka primera og sniðmát, gæti Mg2+ styrkurinn verið hærri.Þess vegna geturðu bætt MgCl2 beint við til að hámarka Mg2+ styrkinn.Mælt er með því að auka Mg2+ 0,5mM í hvert sinn til hagræðingar.

4. PCR mögnunarskilyrðin eru ekki hentug og grunnröðin eða styrkurinn er óviðeigandi.
Tillaga: staðfestu réttmæti grunnröðarinnar og grunnurinn hefur ekki verið brotinn niður;ef mögnunarmerkið er ekki gott, reyndu þá að lækka hitastigið við útgræðsluna og stilla grunnstyrkinn á viðeigandi hátt.

5. Magn sniðmáts er of lítið eða of mikið.
Ráðlegging: Framkvæmdu sniðmátslínugreiningarhallaþynningu og veldu sniðmátsstyrkinn með bestu PCR áhrifunum fyrir rauntíma PCR tilraun.

NTC hefur of hátt flúrljómunargildi

1.Hvarfefnismengun sem stafar af meðan á notkun stendur.
Ráðlegging: Skiptu út fyrir ný hvarfefni fyrir rauntíma PCR tilraunir.

2.Mengun átti sér stað við undirbúning PCR hvarfkerfisins.
Tilmæli: Gerðu nauðsynlegar verndarráðstafanir meðan á notkun stendur, svo sem: að nota latexhanska, nota pípettuodd með síu o.s.frv.

3. Primerarnir eru niðurbrotnir og niðurbrot primeranna mun valda ósértækri mögnun.
Tillaga: Notaðu SDS-PAGE rafdrætti til að greina hvort primerarnir eru niðurbrotnir og skiptu þeim út fyrir nýja primera fyrir rauntíma PCR tilraunir.

Primer dimer eða ósértæk mögnun

1.Mg2+ styrkurinn hentar ekki.
Ráðlegging: Mg2+ styrkur 2× Real PCR EasyTM Mix sem við útvegum er 3,5 mM.Hins vegar, fyrir suma sérstaka primera og sniðmát, gæti Mg2+ styrkurinn verið hærri.Þess vegna geturðu bætt MgCl2 beint við til að hámarka Mg2+ styrkinn.Mælt er með því að auka Mg2+ 0,5mM í hvert sinn til hagræðingar.

2.Hitastig PCR glæðingar er of lágt.
Tillaga: Hækkið PCR-glæðingarhitastigið um 1 ℃ eða 2 ℃ í hvert sinn.

3.PCR varan er of löng.
Ráðlegging: Lengd rauntíma PCR vörunnar ætti að vera á bilinu 100-150bp, ekki meira en 500bp.

4. Primerarnir eru niðurbrotnir og niðurbrot primeranna mun leiða til sérstakrar mögnunar.
Tillaga: Notaðu SDS-PAGE rafdrætti til að greina hvort primerarnir eru niðurbrotnir og skiptu þeim út fyrir nýja primera fyrir rauntíma PCR tilraunir.

5.PCR kerfið er óviðeigandi, eða kerfið er of lítið.
Tillaga: PCR viðbragðskerfið er of lítið mun valda því að greiningarnákvæmni minnkar.Best er að nota hvarfkerfið sem mælir með magn PCR tækinu til að keyra rauntíma PCR tilraunina aftur.

Léleg endurtekningarhæfni magngilda

1.Tækið er bilað.
Tillaga: Það geta verið villur á milli hverrar PCR hola tækisins, sem leiðir til lélegrar endurgerðanleika við hitastýringu eða uppgötvun.Vinsamlegast athugaðu samkvæmt leiðbeiningum á samsvarandi tæki.

2.Hreinleiki sýnisins er ekki góður.
Tilmæli: Óhrein sýni munu leiða til lélegrar endurgerðanleika tilraunarinnar, sem felur í sér hreinleika sniðmátsins og grunna.Best er að endurhreinsa sniðmátið og primerarnir eru best hreinsaðir með SDS-PAGE.

3. Undirbúnings- og geymslutími PCR kerfisins er of langur.
Tillaga: Notaðu rauntíma PCR kerfið fyrir PCR tilraun strax eftir undirbúning og láttu það ekki liggja of lengi.

4. PCR mögnunarskilyrðin eru ekki hentug og grunnröðin eða styrkurinn er óviðeigandi.
Tillaga: staðfestu réttmæti grunnröðarinnar og grunnurinn hefur ekki verið brotinn niður;ef mögnunarmerkið er ekki gott, reyndu þá að lækka hitastigið við útgræðsluna og stilla grunnstyrkinn á viðeigandi hátt.

5.PCR kerfið er óviðeigandi, eða kerfið er of lítið.
Tillaga: PCR viðbragðskerfið er of lítið mun valda því að greiningarnákvæmni minnkar.Best er að nota hvarfkerfið sem mælir með magn PCR tækinu til að keyra rauntíma PCR tilraunina aftur.