Það er vel þekkt að í miðlægu dogmunni er RNA umritunarmiðillinn milli DNA og próteintjáningar.Í samanburði við uppgötvun DNA getur uppgötvun RNA endurspeglað tjáningu gena í lífverum á hlutlægari hátt.Tilraunir sem fela í sér RNA eru ma: qRT-PCR, RNA-Seq og samruna genagreining o.s.frv.. Byggt á eiginleikum RNA sjálfs (sykurhringur RNA hefur einn frjálsan hýdroxýlhóp til viðbótar en sykurhringur DNA), ásamt miklum fjölda RNasa í umhverfinu, er RNA óstöðugra og auðveldara að brjóta niður en DNA.Rusl inn, rusl út, ef gæði RNA eru ekki góð, þá hljóta tilraunaniðurstöður að vera ófullnægjandi, sérstaklega fram sem ónákvæm gögn eða léleg endurtekningarhæfni.Þess vegna ætti að huga betur að vinnslu RNA og tenging gæðaeftirlits er einnig mikilvægari til að tryggja nákvæmni og nákvæmni síðari tilraunagagna.

Til gæðaeftirlits á RNA eru almennt eftirfarandi algengar aðferðir:

• Litrófsmæling
• agarósa hlaup rafskaut
• Agilent lífgreiningartæki
• rauntíma flúrljómandi magn PCR
• Qubit flúrljómandi litunaraðferð

01 Litrófsmæling

RNA hefur samtengd tvítengi og hefur frásogstopp við bylgjulengd 260nm.Samkvæmt lögmáli Lambert-Beer getum við reiknað RNA styrkinn út frá frásogstoppnum við 260nm.Að auki getum við einnig reiknað út hreinleika RNA í samræmi við hlutfall 260nm, 280nm og 230nm frásogstoppa.280nm og 230nm eru frásogstoppar próteina og lítilla sameinda, í sömu röð.Hlutfall A260/A280 og A260/A230 af hæfum RNA hreinleika ætti að vera meira en 2. Ef það er minna en 2 þýðir það að það er prótein- eða smásameindamengun í RNA sýninu og þarf að hreinsa það aftur.Mengunaruppsprettur munu hafa áhrif á tilraunir á eftir, eins og að hindra mögnunarvirkni PCR viðbragða, sem leiðir til ónákvæmar magnniðurstöður.Hreinleiki RNA hefur mikil áhrif á síðari niðurstöður, þannig að litrófsgreining er almennt ómissandi gæðastýringartengil í fyrsta skrefi í kjarnsýrutilraunum.

Mynd 1. Dæmigert RNA/DNA frásogsróf

02 Agarósa hlaup rafskaut

Auk hreinleika er heilleiki RNA einnig einn af mikilvægu vísbendingunum til að dæma gæði RNA.Niðurbrot RNA mun leiða til mikils fjölda stuttra brota í sýninu, þannig að fjöldi RNA brota sem hægt er að greina á áhrifaríkan hátt og ná undir viðmiðunarröðina mun minnka.Hægt er að athuga heilleika RNA með rafdrætti á heildar-RNA á 1% agarósa hlaupi.Þessi aðferð getur stillt hlaupið sjálfur, eða notað forsmíðaða E-Gel™ kerfið til að prófa heilleika.Meira en 80% af heildar RNA er ríbósóma RNA, meirihluti þess er samsett úr 28S og 18S rRNA (í spendýrakerfum).Góð gæði RNA mun sýna tvær augljósar bjartar súlur, sem eru 28S og 18S bjartar stikur, í sömu röð, við 5 Kb og 2 Kb, og hlutfallið mun hafa tilhneigingu til að vera nálægt 2:1.Ef það er í dreifðu ástandi þýðir það að RNA-sýnið gæti hafa verið brotið niður og mælt er með því að nota aðferðina sem lýst er síðar til að prófa gæði RNA frekar.

Mynd 2. Samanburður á niðurbrotnu (braut 2) og ósnortnu RNA (braut 3) á agarósa gel rafdrætti

03 Agilent lífgreiningartæki

Auk agarósa hlaup rafdráttaraðferðarinnar sem lýst er hér að ofan, sem getur hjálpað okkur að bera kennsl á heilleika RNA á einfaldan og fljótlegan hátt, getum við einnig notað Agilent lífgreiningartækið til að ákvarða heilleika RNA.Það notar blöndu af örvökva, háræðarafnám og flúrljómun til að meta styrk og heilleika RNA.Með því að nota innbyggða reikniritið til að greina snið RNA sýnisins getur Agilent lífgreiningartækið reiknað út viðmiðunargildi RNA heilleika, RNA Integrity Number (hér á eftir nefnt RIN) [1].Því hærra sem gildi RIN er, því hærra er heilleiki RNA (1 er mjög niðurbrotið, 10 er fullkomnasta).Sumar tilraunir með RNA benda til þess að nota RIN sem breytu fyrir gæðamat.Með því að taka raðgreiningartilraunir með miklum afköstum (hér eftir nefnt NGS) sem dæmi, benda leiðbeiningar Oncomine™ Human Immune Repertoire, sem er notað til að greina B-frumu- og T-frumumótefnavakaviðtaka í Thermo Fisher's Oncomine pallborðsseríunni, til þess að sýni með RIN gildi sem eru hærri en 4, hægt er að mæla og klóna árangursríkari aflestur (Finesgure).Það eru mismunandi ráðlögð svið fyrir mismunandi spjöld og oft getur hærra RIN fært skilvirkari gögn.

Mynd 3, í Oncomine™ Human Immune Repertoire tilraunum, geta sýni með RIN stærra en 4 greint árangursríkari lestur og T frumuklóna.【2】

Hins vegar hefur RIN gildið einnig nokkrar takmarkanir.Þrátt fyrir að RIN hafi mikla fylgni við gæði NGS tilraunagagna, hentar það ekki fyrir FFPE sýni.FFPE sýni hafa verið efnafræðileg meðhöndluð í langan tíma og útdregið RNA hefur yfirleitt tiltölulega lágt RIN gildi.Hins vegar þýðir þetta ekki að skilvirk gögn tilraunarinnar þurfi að vera ófullnægjandi.Til að meta nákvæmlega gæði FFPE sýna þurfum við að nota aðrar mælingar en RIN.Auk RIN getur Agilent lífgreiningartækið einnig reiknað DV200 gildi sem matsbreytu á RNA gæði.DV200 er breytu sem reiknar út hlutfall brota sem eru stærri en 200 bp í RNA sýni.DV200 er betri vísbending um gæði FFPE sýna en RIN.Fyrir RNA sem dregið er út af FFPE hefur það mjög mikla fylgni við fjölda gena sem hægt er að greina á áhrifaríkan hátt og fjölbreytileika gena [3].Þrátt fyrir að DV200 geti bætt upp fyrir annmarkana á gæðagreiningu FFPE, getur Agilent lífgreiningartækið samt ekki greint gæðavandamálin í RNA sýnum ítarlega, þar á meðal hvort það séu hemlar í sýnunum.Hindrarnir sjálfir geta haft áhrif á mögnunarvirkni niðurstraumstilrauna og dregið úr magni gagnlegra gagna.Til að vita hvort það er hemill í sýninu getum við tekið upp rauntíma flúrljómandi magn PCR aðferð sem lýst er hér á eftir.

04 rauntíma flúrljómandi magn PCR

Rauntíma flúrljómandi megindlega PCR aðferðin getur ekki aðeins greint hemlana í sýninu, heldur einnig endurspegla nákvæmlega gæði RNA í FFPE sýninu.Samanborið við Agilent líffræðilega greiningartæki eru rauntíma magnbundin flúrljómunartæki vinsælli á helstu líffræðilegum rannsóknarstofum vegna víðtækari notkunar þeirra.Til að prófa gæði RNA sýna þurfum við aðeins að kaupa eða undirbúa primer probes fyrir innri viðmiðunargen, eins og GUSB (Vörunúmer Hs00939627).Með því að nota þetta sett af frumurum, rannsaka og stöðlum (heildar-RNA af þekktum styrk) til að framkvæma algjörar magntilraunir, er hægt að reikna út áhrifaríkan RNA-bútastyrk sem matsstaðal fyrir RNA-gæði (Functional RNA Quantitation (FRQ) í stuttu máli).Í NGS prófi komumst við að því að FRQ RNA sýna hefur mjög mikla fylgni við virkt gagnamagni.Fyrir öll sýni sem eru stærri en 0,2ng/uL FRQ geta að minnsta kosti 70% af aflestrinum í raun náð yfir viðmiðunarröðina (Mynd 4).

Mynd 4, FRQ gildi sem greint er með flúrljómunar megindlegri aðferð hefur mjög mikla fylgni (R2>0,9) við áhrifarík gögn sem fengust í NGS tilrauninni.Rauða línan er FRQ gildið jafnt og 0,2 ng/uL (log10 = -0,7).【4】

Auk þess að eiga við um FFPE sýni getur rauntíma magn PCR aðferðin einnig fylgst með hemlum í sýnum á áhrifaríkan hátt.Við getum bætt sýninu sem á að greina inn í hvarfkerfið með innri jákvæðu eftirliti (IPC) og greiningu þess og síðan framkvæmt flúrljómunarmagn til að fá Ct gildi.Ef Ct gildið er á eftir Ct gildinu í viðbrögðum án sýnis, gefur það til kynna að hemillinn sé til staðar í sýninu og hamlar mögnunarvirkni í hvarfinu.

05 Qubit flúrljómandi litunaraðferð

Qubit flúormælir er algengasta litla tækið til að greina kjarnsýrustyrk og hreinleika, sem er auðvelt í notkun og er til í næstum öllum sameindalíffræðirannsóknarstofum.Það reiknar nákvæmlega út styrk kjarnsýru með því að greina og binda kjarnsýru flúrljómandi litarefni (Qubit detection reagent).Qubit hefur mikið næmni og sértækni og getur mælt RNA nákvæmlega niður í pg/µL styrk.Auk hinnar vel þekktu hæfileika til að mæla styrk kjarnsýra nákvæmlega, getur nýjasta nýja gerð Thermo Fisher, Qubit 4.0, einnig greint heilleika RNA.Qubit 4.0's RNA greiningarkerfi (RNA IQ Assay) greinir heilleika RNA með því að greina samtímis tvö sérstök flúrljómandi litarefni.Þessi tvö flúrljómandi litarefni geta tengst stórum brotum og litlum brotum af RNA, í sömu röð.Þessir tveir flúrljómandi litarefni gefa til kynna hlutfall stórra brota af RNA í sýninu og út frá því má reikna greindarvísitölu (Heilleika og gæði) sem táknar RNA gæði.Greindarvísitalan á bæði við um FFPE og sýni sem ekki eru FFPE og hefur mikil áhrif á síðari röðunargæði.Ef NGS tilraunir eru teknar sem dæmi, í RNA-Seq prófunartilraunum sem gerðar voru á Ion torrent™ pallinum, höfðu flest sýni með greindarvísitölugildi hærri en 4 að minnsta kosti 50% árangursríka lestur (Mynd 5).Í samanburði við ofangreindar greiningaraðferðir er Qubit IQ Assay ekki aðeins þægilegra í notkun og tekur styttri tíma (innan fimm mínútna), heldur hefur hún einnig mikla fylgni á milli mældu breytu IQ gildisins og gagnagæða niðurstreymistilrauna.

Mynd 5, það er mikil fylgni á milli Qubit RNA IQ gildisins og kortlagðra lestra RNA-Seq.【5】

Í gegnum ofangreinda kynningu tel ég að allir hafi nægan skilning á mismunandi RNA gæðaeftirlitsaðferðum.Í reynd geturðu valiðsamsvarandi aðferð í samræmi við sýnishornið og núverandi tæki.Aðeins með því að stjórna gæðum RNA vel getum við forðast mistök síðari tilrauna af völdum lélegra sýnagæða og spara þannig dýrmætan tíma, orku og kostnað.

Viðmiðunarvörur:

Animal Total RNA einangrunarsett

Cell Total RNA Einangrunarsett

tilvísanir

【1】 Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. o.fl.RIN: RNA heilleikanúmer til að úthluta heilleikagildum til RNA mælinga.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】 Notendahandbók fyrir Oncomine Human Immune Repertoire (útgáfunr. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】 Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Enhanced Quality Metrics for Assessing RNA Derived From Archival Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Samples, Toxicological Sciences, Volume 3, Issue 170, Issue 3, Issue 170, Issue 3, Issuehttps://doi.org/10.1093/toxsci/