Við höfum verið reyndur framleiðandi.Vinnur meirihlutann í mikilvægum vottunum á markaði sínum fyrir stóran afslátt Kína High Sensitivity One-Step Probe Rt-QpcrKit V2, Gæði er líf verksmiðjunnar, Áhersla á eftirspurn viðskiptavina er uppspretta þess að fyrirtæki lifi af og þróun, Við fylgjumst með heiðarleika og vinnuviðhorfi í góðri trú, hlökkum til að koma!
Við höfum verið reyndur framleiðandi.Að vinna meirihluta í mikilvægum vottunum á markaði sínum fyrirKína Taq DNA pólýmerasi, Qpcr, Fyrirtækið okkar lofar: sanngjörnu verði, stuttum framleiðslutíma og fullnægjandi þjónustu eftir sölu, við fögnum þér líka að heimsækja verksmiðjuna okkar hvenær sem þú vilt.Óska nú að við eigum ánægjuleg og langtíma viðskipti saman!!!

Lýsingar

Þetta sett notar einstakt lýsisbuffakerfi sem getur fljótt losað RNA úr ræktuðum frumusýnum fyrir RT-qPCR viðbrögð og þar með útrýmt tímafrekt og erfiðu RNA hreinsunarferlinu.Hægt er að fá RNA sniðmátið á aðeins 7 mínútum.5×Direct RT Mix og 2×Direct qPCR Mix-SYBR hvarfefnin sem settið býður upp á geta á fljótlegan og áhrifaríkan hátt náð magnbundnum PCR niðurstöðum í rauntíma.

5×Direct RT Mix og 2×Direct qPCR Mix-SYBR hafa sterka hemlaþol og hægt er að nota lýsið af sýnunum sem sniðmát fyrir RT-qPCR beint.Þetta sett inniheldur einstaka Foregene bakritarasa með mikilli sækni RNA og Hot D-Taq DNA pólýmerasa, dNTPs, MgCl₂, hvarfstuðpúði, PCR fínstillingu og sveiflujöfnun.

Tæknilýsing

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

Kit íhlutir

Eiginleikar og kostir

■ Einfalt og áhrifaríkt: með Cell Direct RT tækni er hægt að fá RNA sýni á aðeins 7 mínútum.

■ Eftirspurn eftir sýni er lítil, allt að 10 frumur er hægt að prófa.

■ Mikil afköst: það getur fljótt greint RNA í frumum sem eru ræktaðar í 384, 96, 24, 12, 6-brunnu plötum.

■ DNA Eraser getur fljótt fjarlægt losað erfðamengi, dregið verulega úr áhrifum á síðari tilraunaniðurstöður.

■ Fínstillt RT og qPCR kerfi gerir tveggja þrepa RT-PCR bakritun skilvirkari og PCR sértækari og ónæmari fyrir RT-qPCR viðbragðshemlum.

Kit umsókn

Notkunarsvið: ræktaðar frumur.

- RNA losað með sýnisgreiningu: á aðeins við um RT-qPCR sniðmát þessa setts.

- Settið er hægt að nota í eftirfarandi tilgangi: genatjáningargreiningu, sannprófun á siRNA-miðluðum genaþagnaráhrifum, lyfjaskimun o.fl.

Skýringarmynd

Geymsla og geymsluþol

Hluti I af þessu setti ætti að geyma við 4 ℃;Part II ætti að geyma við -20 ℃.

Foregene Protease Plus II á að geyma við 4 ℃, má ekki frjósa við -20 ℃.

Geyma skal hvarfefni 2×Direct qPCR Mix-SYBR við -20 ℃ í myrkri;ef það er notað oft, er einnig hægt að geyma það við 4 ℃ til skammtímageymslu (notað innan 10 daga). Við höfum verið reyndur framleiðandi.Vinnur meirihluta í mikilvægum vottunum á markaði sínum fyrir stóran afslátt Kína High Sensitivity One-Step Probe Rt-Qpcr Kit V2, Gæði eru líf verksmiðjunnar, Áhersla á eftirspurn viðskiptavina er uppspretta lifun og þróunar fyrirtækisins, Við fylgjumst með heiðarleika og góðri vinnu viðhorf, hlökkum til að koma!
Mikill afslátturKína Taq DNA pólýmerasi, Qpcr, Fyrirtækið okkar lofar: sanngjörnu verði, stuttum framleiðslutíma og fullnægjandi þjónustu eftir sölu, við fögnum þér líka að heimsækja verksmiðjuna okkar hvenær sem þú vilt.Óska nú að við eigum ánægjuleg og langtíma viðskipti saman!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Vörunúmer DRT-01021/01022

Fyrir frumubeina RT-qPCR með ≤ 1000.000 frumum

Vörukynning

Þessi vara notar einstakt lýsisbuffakerfi til að losa fljótt RNA úr ræktuðum frumusýnum fyrir RT-qPCR viðbrögð, útrýma tímafrekt og erfiðu RNA hreinsunarferlinu, og aðeins 7 mínútur til að fá nauðsynlega RNA sniðmát, með 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman sem settið býður upp á getur fengið rauntíma PCR niðurstöður á fljótlegan og skilvirkan hátt.

5× Direct RT Mix og 2× Direct qPCR Mix-Taqman hafa sterka hemlaþol og geta framkvæmt skilvirka viðsnúning og sértæka mögnun með því að nota lýsis sýnisins sem á að mæla sem sniðmát.Hvarfefnið inniheldur Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, Reaction Buffer, PCR Optimizer og Stabilizer, sem hægt er að nota með lysis buffer til að greina sýni á fljótlegan og auðveldan hátt, og hefur einkenni mikils næmis, sértækni og stöðugleika.

Eiginleikar Vöru

Einföld, áhrifarík Cell Direct RT tækni sem tekur allt að 7 mínútur að fá RNA sýni.

Sýnaþörf er lítil og hægt er að nota að minnsta kosti 10 ræktaðar frumur til tilrauna.

Mikil afköst fyrir hraða RNA-upptöku ræktaðra fruma eins og 384, 96, 24, 12 og 6-brunna plötur.

DNA Eraser er fær um að fjarlægja losað erfðamengi fljótt, sem dregur verulega úr áhrifum á síðari tilraunaniðurstöður.

Fínstillt RT- og qPCR-kerfi gera tveggja þrepa RT-PCR kleift með skilvirkari öfugumritun, sérhæfni og sterkara RT-qPCR viðbragðshemlaþoli.

Kit umsókn

Notkunarsvið: Ræktaðar frumur.

Sýnisleysi túlkað RNA: aðeins notað sem tveggja þrepa RT-qPCR sniðmát.

Hægt er að nota sett í eftirfarandi tilgangi: greiningu á genastjórnunartjáningu, samsætuprófun, lyfjaskimun o.s.frv.

Takmarkanir setts

Magnað brot ≤ 300 bp.

Sett eru notuð til að nýrækta frumur.

Gæðaeftirlit vöru

Samkvæmt heildargæðastjórnunarkerfi FOREGENE er hver lota af Cell Direct RT-qPCR röð settum stranglega prófuð margsinnis til að tryggja áreiðanleika og stöðugleika gæði hvers lotu setta.

Innihald setts

*:Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman er hægt að kaupa sérstaklega, nánari upplýsingar eru veittar í 1. viðauka (SÍÐA 13).

Geymsluskilyrði

1. Sendingarskilmálar

Allt ferlið við flutning á íspoka með lágum hita, til að tryggja að settið sé í <4 °C ástandi.

2. Geymsluskilyrði

Geymið hluta I við 4°C og hluta II við -20°C.

Foregene Protease Plus II skal geyma við 4°C, ekki frysta við -20°C.

Reagent 2× Direct qPCR Mix-Taqman er geymt við -20°C, eða við 4°C til skammtímanotkunar ef það er notað oft (innan 10 daga).

Upplýsingar um Kit íhluti

Buffer CL: Veitir það umhverfi sem þarf fyrir frumulýsuviðbrögð.

Buffer ST: Lokar virka efninu í lysatinu til að forðast áhrif á síðari RT.

DNA Eraser: DNA fjarlægja, áhrif þess að fjarlægja erfðamengi á síðari tilraunir.

5× Direct RT Blanda: Inniheldur mikla RNA sækni Foregene Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, dNTPs, stabilizers, enhancers, optimizers, and reverse transcription primers for best alignment (Random Primer, Oligo(dT)₁₈Grunnur).

Foregene Protease Plus II: Í samhengi við leysistuðpúða eru frumur leystar til að losa kjarnsýrur.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: Þetta hvarfefni inniheldur heitt D-Taq DNA pólýmerasa, dNTP, MgCl₂, hvarfstuðpúða, PCR fínstillingu og stöðugleika.

20× ROX Reference Dye: Almennt notað á rauntíma PCR mögnunartækjum ABI, Stratagene og annarra fyrirtækja, það er notað til að stilla muninn á PCR glösum og slöngum af völdum PCR skammtavillna.20× ROX Reference Dye styrkurinn sem þarf fyrir mismunandi tæki er mismunandi og notandinn getur bætt því við í samræmi við ráðlagðan styrk tækisins.

RNase-frjáls ddH₂O: RNase-frítt sótthreinsað ofurhreint vatn fyrir tveggja þrepa RT-qPCR viðbrögð.

Varúðarráðstafanir:(Vertu viss um að lesa varúðarráðstafanirnar vandlega áður en settið er notað)

Gefðu gaum að vinnsluaðferð tilraunarinnar til að forðast krossmengun milli sýna.

Gefðu gaum að hreinleika tilraunaumhverfisins og áhöldum til að forðast RNase mengun og niðurbrot RNA.

Taktu fersk eða vel varðveitt frumusýni og notaðu aldrei endurtekin frystþídd frumusýni.

5× Direct qPCR Mix,2× Direct qPCR Mix-Taqman ætti að forðast endurtekna frystingu-þíðingu, annars mun það hafa áhrif á öfuga umritun og PCR skilvirkni.

Undirbúningurskömmtumáðuraðgerð

Vertu viss um að lesa leiðbeiningarnar vandlega áður en þú notar þetta sett.Cell Direct RT-qPCR Kit er einfalt, þægilegt og fljótlegt í notkun og leiðbeiningarnar veita allar upplýsingar um allt settið og hvernig á að nota það rétt.Vinsamlegast undirbúið nauðsynleg tilraunaefni og búnað fyrir notkun.

Tilraunaefni og búnaður

◆ Menningarfrumur.

◆ 1,5 ml eða 2 ml, RNase-/DNase-frí skilvindurör, RNase-/DNase-frjáls oddur, 0,2 ml dauðhreinsað qPCR rör.

◆ qPCR vél, pípetta, borðskilvinda (≥13.400×g) (fer eftir tilraunaþörfum) o.s.frv.

Öryggi

◆ Þessi vara er eingöngu til vísindarannsókna, vinsamlegast ekki nota hana í lyfjafræðilegum, klínískum, matvæla- og snyrtivörum.

◆ Þegar þú notar efni skaltu nota viðeigandi rannsóknarfatnað, hanska, hlífðargleraugu o.s.frv.

Aðgerðleiðsögumenn

Hægt er að kaupa frumulýsukerfi, RT-kerfi og qPCR-viðbragðslausnaruppbótarpakka sérstaklega, fyrir nánari upplýsingar í 1. viðauka (SÍÐA 13).

Rekstrarleiðbeiningar

A: Sýnishorn af RNA losun

1. Frumur voru formeðhöndlaðar: Þvoið frumuræktunarplötuna með köldu PBS, lýsið síðan frumurnar (10-10⁶), 10⁶ en magn frumna, er mælt með því að búa til frumuna og RNA einangrunarsettið Total (DE-03111) eða Animal Total RNA einangrunarsett (DE-03011) fyrir RNA útdrátt og hreinsun.

1.1.Viðloðandi frumur (24-brunn plata sem dæmi)

1.1.1.Ákvarðu fjölda frumna í hverjum brunni, ákvarðaðu að fjöldi frumna sé 1 × 10⁵, og notaðu pípettu til að fjarlægja ræktunarmiðilinn úr ræktunarskálinni.

1.1.2.Bætið 200 μl af forkældu 1 × PBS í hverja brunn.Ekki pípetta endurtekið og fjarlægja PBS úr brunnunum.Hallaðu plötunni og fjarlægðu eins mikið PBS og mögulegt er.Haltu áfram að skrefi 2.

1.1.3.Öðruvísi frumuræktunarskál eða tilvísunarnúmeratöflu 1-1 í frumuræktarskál var bætt við forkældum 1 × PBS fyrir frumuþvott.

Tafla 1-1: PBS skammtur fyrir mismunandi fjölda frumna

Athugið：Til að tryggja þétt viðloðandi frumur，mikill fjöldi frumutaps forðast við þvott.

1.2.Sviffrumur eða viðloðandi frumur ræktaðar í plötum sem ekki eru gljúpar

1.2.1.Viðloðandi frumur ræktaðar í plötum sem ekki eru með mörgum brunnum (sviffrumur byrja á næsta skrefi 1.2.2), safna og aðskilja frumurnar samkvæmt venjulegri frumusöfnunaraðferð og setja þær í ræktunarplötu eða skilvindurör;ef trypsínvæðing er notuð, þarf skilvindu til að safna frumunum og til að fjarlægja trypsínleifar, bætt PBS endursviflausnum frumum í einstakar frumur til að dreifa frumunum.

1.2.2.Eftir að fjöldi frumna hefur verið talinn, skiptar frumum í skammtaskammt 1×10⁵ einn til að skilja rör, safna frumum með skilvindu við 1000 × g í 10 mín.

1.2.3.Bætið 200 μl PBS við skilvindurörið, ekki pípetta endurtekið og sogið PBS beint út.Haltu áfram í skref 2. (Ef erfitt er að fella út og frumurnar voru endurblandaðar aftur, má framkvæma 1000×g skilvindu 10 mínútum eftir að flotinu hefur verið fargað, þá heldur frumukillan áfram í skref 2)

2. Frumugreining: Fjarlægðu Buffer CL, hitastig hans jafnað við stofuhita, DNA Eraser og Foregene Protease Plus II, í samræmi við eftirfarandi töflu 1-2 undirbúið leysikerfi: (Lysislausn er tilbúin til notkunar).

Tafla 1-2: klofningur kerfisundirbúningur (Athugið: í undirbúningi á ís)

3.( 24-brunn plata sem dæmi) Pípettið 200 μl af frumulýsingarblöndu í hvern brunn, blásið endurtekið 5-10 sinnum, ræktið við stofuhita (20-25 ℃) í 5 mín.

Athugið：Til að koma í veg fyrir myndun loftbóla, vinsamlegast þegar pípettukvarðinn var stilltur á 200μl eða minna.Frumurnar geta birst skýjaðar eftir leysingu, sem er eðlilegt.

4.(24-brunn plötu sem dæmi) er bætt út í vökvann. 20 μl Buffer ST (mismunandi lysiskerfi Buffer ST bætt við í magni sem sýnt er í töflu 1-3), endurtekin pípulagning 5-10 sinnum, við stofuhita (20-25 ℃) voru ræktuð í 2 mín.

Athugið：Pípettuoddinum var komið fyrir neðan yfirborðið og tryggði að lýsinu væri bætt við，til að forðast myndun loftbóla, vinsamlegast þegar pípettukvarðinn var stilltur á 200μl eða minna.

Tafla 1-3：Bæta við Buffer ST

5.Lýsatið er notað fyrir síðari RT-qPCR tilraunir.Ef ekki er hægt að framkvæma síðari tilraunir í tæka tíð, vinsamlegast hafðu það á ís í ekki meira en 2 klst og geymdu við -20 ℃ eða -80 ℃ (ekki lengur en þrjá mánuði).

B: RT kerfi undirbúningur

1.Taktu út 5 × Direct RT Mix og settu það á ísbað, láttu það bráðna náttúrulega og blandaðu því varlega saman til síðari notkunar;taktu út RNase-Free ddH2O og bræddu það og settu það á ísbað til síðari notkunar.Undirbúið hvarfkerfið á ís samkvæmt töflu 2-1 hér að neðan.

Tafla 2-1: Undirbúningur RT hvarfkerfis

2.Eftir að kerfissamsetning hefur verið lokið, blandað varlega og skilið stuttlega í skilvindu í eftirfarandi töflu 2 -2 hvarfskilyrði RT hvarf.

Tafla 2-2: RT Reaction ástandsstilling

3.Eftir að hvarfinu var lokið var hvarfafurðin sett beint á ís fyrir qPCR, vinsamlegast settu langtímavarðveisluna -20 ℃ eða -80 ℃.

Athugið: Vegna notkunar á óhreinsuðu sniðmáti getur hvítt botnfall birst í öfugum umritunarafurðinni.Þetta er eðlilegt fyrirbæri.Settu fljótandi vökvann strax í miðflótta fyrir síðari tilraunir.

RT hvarflausninni sem myndast er bætt við næstu skref rauntíma PCR hvarfkerfi, mælt er með því að bæta við magni á bilinu 10-30% af hvarfkerfinu.

C: undirbúningur qPCR hvarfkerfis

1. Viðeigandi magn af B útbúið í skrefi cDNA sniðmáti samkvæmt eftirfarandi töflu 3-1 til að útbúa hvarfkerfi.

Athugið: Magn cDNA sniðmáts er 10-30% af qPCR kerfinu.Til dæmis, í 20μl qPCR kerfi, bætið við 2-6 μl af lýsisbuffi, en ekki meira en 6 μl.

2. Hagræðingin góð qPCR skilyrði (glæðingarhitastig, osfrv.) fyrir qPCR viðbrögð (Hvarfskilyrðin sem gefin eru upp í töflu 3-2).

Athugið: Reyndu að nota bjartsýni skilyrði fyrir qPCR viðbrögð til að ná betri árangri.

Tafla 3-1: Undirbúningur PCR hvarfkerfis

1*: Hægt er að stilla styrk grunns á bilinu 50-900 nM þegar árangur grunnhvarfsins er lélegur.

Athugið: Hægt er að stilla qPCR kerfið í samræmi við tilraunaþarfir og flúrljómunarlíkan.Fyrir qPCR í 50μl kerfi, stilltu hvarfefnisskammtinn hlutfallslega í samræmi við 20μl kerfi.

2*: Veldu viðeigandi lokastyrk af ROX Reference Dye í samræmi við flúrljómunarmagnshitahringrásina.Hæsti styrkur ROX viðmiðunarlitarefnis fyrir algenga flúrljómunarmagnshringrás er sýndur í töflunni hér að neðan:

Tafla 3-2: qPCR hvarfskilyrði eru gefin upp

Athugið: Til að ná sem bestum qPCR áhrifum er hægt að nota halla PCR til að hámarka hvarfaðstæður fyrir mismunandi sniðmát og mismunandi grunna.PCR hvarfskilyrði eru breytileg eftir flúrljómunargreiningartækinu, sniðmátinu, grunninum o.s.frv. Í tilteknu aðgerðinni þarf að hanna bestu hvarfskilyrðin í samræmi við sérstakar aðstæður flúrljómunar magnvarma hringrásarinnar, sniðmátsgerð, stærð hlutans sem vekur áhuga, basaröð mögnuðu brotsins og GC innihald og lengd grunnunar, þar með talið viðbragðstíma, o.s.frv.

Real Time PCR grunnur hönnunarreglur

Forward Primer og Reverse Primer

Fyrir rauntíma PCR er grunnhönnun mjög mikilvæg.Primers tengjast sérhæfni og skilvirkni PCR mögnunar og er hægt að hanna með vísan til eftirfarandi meginreglna:

◆ Grunnur lengd: 18-30bp.

◆ GC innihald: 40-60%.

◆ Tm gildi: Grunnhönnunarhugbúnaður, eins og Primer 5, getur gefið Tm gildi grunnsins.Tm-gildi uppstreymis og niðurstreymis primers ættu að vera eins nálægt og hægt er.Tm reikniformúluna er einnig hægt að nota: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Þegar PCR er framkvæmt er hitastig undir grunngildi Tm 5 °C almennt valið sem hitastig fyrir glæðingu (samsvarandi hækkun á hitastigi hitastigsins getur aukið sérhæfni PCR hvarfsins).

◆ Grunnur og PCR vörur:

◆ Hönnun primer PCR mögnunarafurðarlengd er helst 100-150bp.

◆ Forðast skal hönnunargrunna á aukabyggingarsvæði sniðmátsins eins mikið og mögulegt er.

◆ Forðastu myndun 2 eða fleiri sambótabasa á milli 3′ enda uppstreymis og downstream primers.

◆ Grunnur 3′ endastöð getur ekki verið til staðar með 3 viðbótar G eða C í röð.

◆ Primerarnir sjálfir geta ekki haft viðbótarbyggingar, annars myndast hárnálabygging sem hefur áhrif á PCR mögnun.

◆ ATCG skal dreift eins jafnt og hægt er í grunnröðinni og forðast skal 3′ enda basann sem T.

Viðauki1：Cell BeintRT-qPCR Kit hlutit viðbót pakki

1.Cell Lysis Solution