Ófrjósemisaðgerð á pípettuoddum og EP slöngum o.fl.

1. Undirbúið 0,1% (eitt þúsundasti) DEPC (mjög eitrað efni) með afjónuðu vatni, notaðu það varlega í reykháfum og geymdu það við 4°C fjarri ljósi;

DEPC vatn er hreint vatn meðhöndlað með DEPC og sótthreinsað með háum hita og háþrýstingi.Prófað til að vera laust við RNase, DNase og próteinasa.

2. Settu pípettuoddinn og EP rörið í 0,1% DEPC og tryggðu að pípettuoddurinn og EP rörið séu fyllt með 0,1% DEP.

3. Verndaðu gegn ljósi, láttu standa yfir nótt (12-24 klst.)

4. Kassinn sem inniheldur oddinn og EP rörið þarf ekki að liggja í bleyti í DEPC.Eftir að hafa fjarlægt DEPC vatnið í oddinum eða EP túpunni gróflega skaltu pakka því saman og pakka því inn.

5. 121 gráður á Celsíus, 30mín

6. 180 gráður á Celsíus, þurrt í nokkrar klukkustundir (að minnsta kosti 3 klukkustundir)

Athugið: a.Notaðu latexhanska og grímur þegar þú meðhöndlar DEPC!b, eða án DEPC dauðhreinsunar, 130 ℃, 90 mín autoclave (margar rannsóknarstofur háhita dauðhreinsun tvisvar)

RNA útdráttarsjónarmið

Tvö helstu fyrirbæri vegna bilunar í einangrun RNA vefja

RNA niðurbrot og leifar óhreininda í vefjum,varðandi niðurbrot, skulum fyrst skoða hvers vegna RNA sem unnið er úr ræktuðum frumum brotnar ekki auðveldlega niður.Núverandi RNA útdráttarhvarfefni innihalda öll efni sem hindra RNase hratt.Bætið lýsinu við ræktuðu frumurnar og blandið því einfaldlega saman, hægt er að blanda öllum frumunum vandlega saman við lýsið og frumurnar eru alveg leystar.Eftir að frumurnar hafa verið lýsaðar hamla virku innihaldsefnin í lýsatinu strax innanfrumu RNase, þannig að RNA er ósnortið.Það er að segja, vegna þess að ræktuðu frumurnar komast auðveldlega og fullkomlega í snertingu við lýsatið, er RNA þeirra ekki auðveldlega brotið niður;á hinn bóginn er RNA í vefnum auðveldlega brotið niður vegna þess að frumurnar í vefnum eiga ekki auðvelt með að komast fljótt í snertingu við lýsatið.vegna nægrar umgengni.Svo,að því gefnu að það sé leið til að breyta vefnum í eina frumu á meðan hann hamlar RNA-virkni, gæti niðurbrotsvandamálið verið leyst algjörlega.

Mölun á fljótandi köfnunarefni er áhrifaríkasta slíka aðferðin.Hins vegar er fljótandi köfnunarefnis mölunaraðferðin mjög erfið, sérstaklega þegar fjöldi sýna er mikill.Þetta gaf tilefni til þess næstbesta: einsleitni.Theeinsleitariaðferðin veltir ekki fyrir sér spurningunni um hvernig RNase virkni er hindrað áður en frumur eru komnar í snertingu við lýsatið, heldur biður um að hraði vefjarofs sé hraðari en hraðinn sem innanfrumu RNase brotnar niður RN.

Áhrif rafmagns einsleitara eru betri,og áhrif einsleitar glers eru léleg, en almennt getur einsleitaraðferðin ekki komið í veg fyrir niðurbrotsfyrirbæri.Þess vegna, ef útdrátturinn er niðurbrotinn, ætti að nota upprunalega rafmagns einsleitarefnið til að mala með fljótandi köfnunarefni;Breyta ætti upprunalega glerjöfnunarbúnaðinum í rafmagnsjafnara eða mala beint með fljótandi köfnunarefni.Vandamálið er næstum 100% framkvæmanlegt.fá leyst.

Vandamál óhreinindaleifa sem hafa áhrif á síðari tilraunir á sér fjölbreyttari orsakir en niðurbrot og lausnirnar eru samsvarandi mismunandi.Að lokum,ef það er niðurbrot eða leifar óhreininda í vefnum verður að fínstilla útdráttaraðferðina/hvarfefnið fyrir tiltekna tilraunaefnið.Þú þarft ekki að nota dýrmætu sýnin þín til hagræðingar: þú getur keypt smá dýr eins og fisk/kjúkling af markaðnum, tekið samsvarandi hluta af efninu til RNA-útdráttar og hinn hlutinn fyrir próteinútdrátt – mala með munni, maga og þörmum.

Mark-RNA af útdregnu RNA er notað fyrir mismunandi eftirfylgnitilraunir og gæðakröfur þess eru mismunandi

cDNA bókasafnsbygging krefst RNA heilleika án leifa af ensímhvarfshemlum;Northern krefst meiri RNA heilleika og minni kröfur um leifar ensímhvarfshemla;RT-PCR krefst ekki of mikils RNA heilleika,en hamlar ensímhvörfum.Kröfur um leifar eru strangar.Inntakið ákvarðar úttakið;í hvert skipti sem markmiðið er að fá hæsta hreinleika RNA mun það kosta fólkið og peningana.

Söfnun/geymsla sýna

Þættir sem hafa áhrif á niðurbrot Eftir að sýnið yfirgefur lifandi líkamann/eða upprunalega vaxtarumhverfið munu innræn ensím í sýninu byrja að brjóta niður RNA,og niðurbrotshraðinn er tengdur innihaldi innrænna ensíma og hitastigi.Hefð er fyrir því að það eru aðeins tvær leiðir til að hindra fullkomlega virkni innrænna ensíma: bæta lýsati strax við og gera einsleitt vandlega og hratt;skera í litla bita og frysta strax í fljótandi köfnunarefni.Báðar aðferðir krefjast hraðvirkrar notkunar.Hið síðarnefnda hentar öllum sýnum en hið fyrra hentar aðeins vefjum með lágt innihald frumna og innrænna ensíma og auðveldara að einsleita þær.Nánar tiltekið er best að frysta plöntuvef, lifur, hóstarkirtli, bris, milta, heila, fitu, vöðvavef osfrv. með fljótandi köfnunarefni áður en haldið er áfram.

Sundrun og einsleitun sýna

Þættir sem hafa áhrif á niðurbrot og afrakstur Sýnisbrot erfyrir ítarlega einsleitni, sem er fyrir fullkomna og fullkomna losun RNA.Hægt er að gera frumur beint einsleitar án þess að þær séu brotnar.Aðeins er hægt að gera vefi einsleita eftir að hafa verið brotnir.Það þarf að brjóta ger og bakteríur með samsvarandi ensímum áður en hægt er að gera þau einsleit.Hægt er að mylja og einsleita vefi með lægra innrænt ensíminnihald og auðveldari einsleitni í einu í lýsinu með einsleitara;plöntuvefur, lifur, hóstarkirtill, bris, milta, heili, fita, vöðvavefur og önnur sýni, þau innihalda annað hvort mikið af innrænum ensímum eða eru ekki auðveldlega einsleitar,þannig að vefjaröskun og einsleitni verða að fara fram sérstaklega.Áreiðanlegasta og afkastamesta sundunaraðferðin er mölun með fljótandi köfnunarefni og áreiðanlegasta aðferðin við einsleitni er að nota rafmagns einsleitara.Sérstök athugasemd um mölun með fljótandi köfnunarefni: sýnið má ekki þíða á öllu mölunarferlinu, þar sem innræn ensím eru líklegri til að virka þegar það er frosið.

Val um lýsat

Hafa áhrif á þægindi í rekstri og þætti afgangs innrænna óhreininda. Algengt er að lýsislausnirnar geti nánast hamlað virkni RNase.Þess vegna er lykilatriðið við að velja leysislausn að íhuga það ásamt hreinsunaraðferðinni.Það er ein undantekning:Mælt er með sýnum með hátt innrænt ensíminnihald til að nota lýsat sem inniheldur fenól til að auka getu til að óvirkja innræn ensím.

Val á hreinsunaraðferð

Þættir sem hafa áhrif á leifar innrænna óhreininda, útdráttarhraða Fyrir hrein sýni eins og frumur er hægt að fá fullnægjandi niðurstöður með nánast hvaða hreinsunaraðferð sem er fyrir hendi.En fyrir mörg önnur sýni, sérstaklega þau sem innihalda mikið magn óhreininda eins og plöntur, lifur, bakteríur osfrv., er mikilvægt að velja viðeigandi hreinsunaraðferð.Miðflóttahreinsunaraðferð súlu hefur hraðan útdráttarhraða og getur í raun fjarlægt óhreinindi sem hafa áhrif á síðari ensímhvörf RNA, en hún er dýr (Foregene getur boðið hagkvæmar pökkum, nánari upplýsingar smelltu áhér);með því að nota hagkvæmar og klassískar hreinsunaraðferðir, eins og LiCl-útfellingu, er einnig hægt að ná viðunandi árangri, en aðgerðatíminn er langur..

„Þrjár greinar og átta athygli“ fyrir RNA útdrátt

Fræðigrein 1:Bættu enda á mengun utanaðkomandi ensíma.

Athugasemd 1:Notaðu stranglega grímur og hanska.

Athugasemd 2:Farga skal vandlega skilvindurörunum, oddhausunum, pípettustöngunum, rafskautargeymunum og tilraunabekkunum sem taka þátt í tilrauninni.

Athugasemd 3:Hvarfefnin/lausnirnar sem taka þátt í tilrauninni, sérstaklega vatn, verða að vera RNase-lausar.

Fræðigrein 2:Hindra virkni innrænna ensíma

Athugasemd 4:Veldu viðeigandi einsleitunaraðferð.

Athugasemd 5:Veldu viðeigandi lýsat.

Athugasemd 6:Stjórnaðu upphafsmagni sýnisins.

Fræðigrein 3:Skýrðu útdráttartilgang þinn

Athugasemd 7:Með hvaða lýsiskerfi sem er sem nálgast hámarks upphafsmagn sýnis, lækkar árangur útdráttar verulega.

Athugasemd 8:Eina efnahagslega viðmiðunin fyrir árangursríka RNA-útdrátt er árangur í síðari tilraunum, ekki ávöxtun.

Top 10 uppsprettur RNase mengunar

1. Fingur eru fyrsta uppspretta utanaðkomandi ensíma, þannig að hanska þarf að nota og skipta oft út.Að auki verður einnig að nota grímur, því öndun er einnig mikilvæg uppspretta ensíma.Annar ávinningur af því að vera með hanskagrímu er að vernda tilraunamanninn.

2. Pípettuoddar, skilvindurör, pípettur - Ekki er hægt að gera RNase óvirkt með dauðhreinsun eingöngu, þannig að pípettuoddar og skilvindurör ætti að meðhöndla með DEPC, jafnvel þótt þau séu merkt sem DEPC meðhöndluð.Best er að nota sérstaka pípettu, þurrka hana með 75% alkóhóli bómull fyrir notkun, sérstaklega stöngina;að auki, vertu viss um að nota ekki höfuðfjarlægingu.

3. Vatnið/buffarinn verður að vera laus við RNase mengun.

4. Að minnsta kosti ætti að þurrka prófunarborðið af með 75% alkóhóli bómullarkúlum.

5.Endogenous RNase Allir vefir innihalda innræn ensím, svo hröð frysting vefja með fljótandi köfnunarefni er besta leiðin til að draga úr niðurbroti.Aðferðin til að geyma/mala fljótandi köfnunarefni er vissulega óþægileg, en hún er eina leiðin fyrir vefi með mikið magn innrænna ensíma.

6. RNA sýni RNA útdráttarafurðir geta innihaldið snefil af RNase mengun.

7. Plasmíðútdráttur Plasmíðútdráttur notar oft RNAse til að brjóta niður RNA og ætti að melta afganginn af RNAse með próteinasa K og draga út með PCI.

8. RNA geymsla Jafnvel þótt það sé geymt við lágt hitastig mun snefilmagn af RNase valda niðurbroti RNA.Besta lausnin fyrir langtíma varðveislu RNA er salt/alkóhólsviflausn, því alkóhól hindrar alla ensímvirkni við lágt hitastig.

9. Þegar katjónir (Ca, Mg) innihalda þessar jónir mun hitun við 80C í 5 mínútur valda því að RNA klofnar, þannig að ef hita þarf RNA þarf varðveislulausnin að innihalda klóbindandi efni (1mM natríumsítrat, pH 6,4).

10. Ensím sem notuð eru í síðari tilraunum geta verið menguð af RNase.

10 ráð fyrir RNA útdrátt

1: Komdu fljótt í veg fyrir RNase virkni.Sýni eru fljótfryst eftir söfnun og RNase er óvirkjað með hraðri aðgerð meðan á lýsi stendur.

2: Veldu viðeigandi útdráttaraðferð fyrir vef með hátt innihald ríbósíms og fituvef er best að nota aðferðina sem inniheldur fenól.

3: Spágæði krefjast Northern, smíði cDNA bókasafns krefst mikillar heilleika og RT-PCR og RPA (Ribonuclease Protection Assay) þurfa ekki mikla heilleika.RT-PCR krefst mikils hreinleika (ensímhemlaleifar).

4: Ítarleg einsleitun er lykillinn að því að bæta uppskeru og draga úr niðurbroti.

5: Athugaðu heilleika RNA rafdráttargreiningar, 28S: 18S = 2: 1 er algjört merki, 1: 1 er einnig ásættanlegt fyrir flestar tilraunir.

6: Fjarlæging á DNA fyrir RT-PCR, fylkisgreining Best er að nota Dnasa I til að fjarlægja DNA.

7: Draga úr mengun utanaðkomandi ensíma - ensím er ekki hægt að flytja inn að utan.

8: Við þéttingu kjarnsýra með lágstyrk skal bæta við útfellingarhvarfefni.En til að koma í veg fyrir að samútfellingarefnið inniheldur ensím og DNA mengun.

9: Leysið RNA vandlega upp, ef þarf, hitið við 65C í 5 mínútur.

viðeigandi geymsluaðferð

Það er hægt að geyma við -20C í stuttan tíma og við -80C í langan tíma.Fyrsta skrefið í að bæta RNA afköst er að átta sig á því að RNA innihald mismunandi sýna er mjög mismunandi.Mikið magn (2-4 ug/mg) eins og lifur, bris, hjarta, miðlungs gnægð (0,05-2 ug/mg) eins og heili, fósturvísir, nýru, lungu, hóstarkirtli, eggjastokkar, lítið magn (<0,05 ug/mg) mg) eins og þvagblöðru, bein, fita.

1: Lýsa frumur til að losa RN - ef RNA er ekki losað mun afraksturinn minnka.Rafknúin einsleitun virkar betur en aðrar einsleitaraðferðir, en gæti einnig þurft að sameina þær við aðrar aðferðir, eins og fljótandi köfnunarefnis mauk, ensímmeltingu (Lysozyme/Lyticase)

2: Hagræðing útdráttaraðferðar.Stærstu vandamálin við aðferðir sem byggjast á fenól eru ófullkomin lagskipting og RNA tap að hluta (ekki er hægt að fjarlægja flotið að fullu).Ófullkomin lagskipting stafar af háu kjarnsýru- og próteininnihaldi, sem hægt er að leysa með því að auka magn lýsis sem notað er eða minnka magn sýnis.Skref klóróformútdráttar var bætt við fituvefinn.Hægt er að draga úr RNA tapi með því að dæla aftur eða með því að fjarlægja lífræna lagið og síðan skilvinda.Stærsta vandamálið við aðferðir sem byggja á súluskilvindu er umframsýni.

Klassísk ráð um útdrátt

1. Fenólhreinsun: Bætið við jöfnu magni af 1:1 fenól/klórformi og blandið kröftuglega í 1-2 mínútur.Miðflöt á miklum hraða í 2 mínútur.Fjarlægðu fljótandi vökvann varlega (80-90%).Aldrei komast í miðlagið.Jafnt rúmmál af hvarflausninni má bæta við fenól/klóróform og fjarlægja flotið.Hægt er að blanda tveimur flotunum saman fyrir kjarnsýruútfellingu til að bæta afraksturinn.Vertu ekki of varkár þegar þú blandar saman og reyndu ekki að fjarlægja allt flotið.

2. Þvottur með 70-80% etanóli: Við þvott þarf að dreifa kjarnsýrunni til að tryggja að saltleifarnar skolist burt.Jafnframt, strax eftir að etanólinu hefur verið hellt af, skal skilvinda á miklum hraða í nokkrar sekúndur og síðan fjarlægja afganginn af etanóli með pípettu.Leysið upp eftir að hafa staðið við stofuhita í 5-10 mínútur.

11. Útdráttur sérsamtaka

1. Trefjavefur: Lykillinn að útdrætti RNA úr trefjavef eins og hjarta/beinagrindvöðva er að trufla vefinn algjörlega.Þessir vefir hafa lágan frumuþéttleika, þannig að magn RNA á hverja þyngdareiningu vefja er lítið og best er að nota eins mikið upphafsmagn og mögulegt er.Vertu viss um að mala vefinn vandlega við frostmark.

2. Vefur með hátt prótein/fituinnihald: fituinnihald heila/grænmetis er hátt.Eftir PCI útdrátt inniheldur flotið hvítar flokkar.Yfirvatnið verður að draga út aftur með klóróformi.

3. Vefur með mikið kjarnsýru/ríbósím innihald: milta/hóstarkirtli hefur mikið kjarnsýru- og ríbósím innihald.Maölun vefja við frostskilyrði og síðan hröð einsleitun getur í raun gert ríbósím óvirkt.Hins vegar, ef lýsatið er of seigfljótt (vegna mikils kjarnsýruinnihalds), mun PCI útdrátturinn ekki geta lagst á áhrifaríkan hátt;að bæta við meira lysati getur leyst þetta mál.Margfeldi PCI útdráttur getur fjarlægt meira af DNA leifar.Ef hvítt botnfall myndast strax eftir að áfengi hefur verið bætt við bendir það til DNA-mengunar.Endurútdráttur með súru PCI eftir upplausn getur fjarlægt DNA mengun.

4. Plöntuvefur: Plöntuvefur er flóknari en dýravefur.Almennt eru plöntur malaðar við fljótandi köfnunarefni, þannig að niðurbrot RNA af innrænum ensímum er sjaldgæft.Ef niðurbrotsvandamálið er ekki leyst er það næstum örugglega af völdum óhreininda í sýninu.Óhreinindin sem eru í mörgum plöntum munu leiða til leifa og ástæðan fyrir leifum er oft sú að þessi óhreinindi eru lík RNA: þú botnar út og ég fellur út og þú aðsogar og ég aðsogast.Þessir eiginleikar ákvarða að þeir eru mjög sterkir ensímhemlar.

Sem stendur er hægt að laga RNA-útdráttarhvarfefni í verslun að næstum öllum dýravef með litlum aðlögun, en það eru fá RNA-útdráttarhvarfefni sem henta flestum plöntuvefjum.Sem betur fer getur Foregene veitt sérstaktRNA útdráttarsett fyrir plöntur, við höfumPlant Total RNA einangrunarsett, Plant Total RNA Einangrunarsett Plus.Hið síðarnefnda er sérstaklega hannað fyrir plöntur með mikið fjölsykrur og fjölfenól innihald.Fyrir RNA útdrátt er endurgjöf frá rannsóknarstofunotendum sérstaklega góð.

12. Áhrif frystingar og þíðingar sýna. Frosta sýnið getur verið stærra og það þarf að skera það áður en það er notað til RNA-útdráttar.Sýni hafa tilhneigingu til að bráðna (hugsanlega að hluta) meðan á skurði stendur.Það gæti þurft að vigta frosin sýni fyrir RNA útdrátt og þíðing mun örugglega eiga sér stað meðan á þessu ferli stendur.Stundum er þíðing sýnisins einnig á meðan á fljótandi köfnunarefnismölunarferlinu stendur;eða frosna sýninu er beint bætt við lýsið án þess að mala fljótandi köfnunarefni, og þíðing mun örugglega eiga sér stað áður en fullkomið er einsleitt.Tilraunir hafa sýnt að frosinn vefur er hættara við niðurbroti RNA við þíðingu en ferskur vefur.Líkleg ástæða: Frost-þíða ferlið truflar mannvirki innan frumunnar, sem auðveldar innrænum ensímum að komast í beina snertingu við RNA.

13. Mat á RNA gæðum Venjulega er rafskaut notuð til að dæma heilleika RNA og A260/A280 er notað til að dæma hreinleika RNA.Fræðilega séð hefur ósnortið RNA hlutfallið 28S:18S = 2,7:1 og flest gögn leggja áherslu á hlutfallið 28S:18S = 2:1.Staðreyndin er sú að nánast ekkert af RNA sem er dregið úr öðrum sýnum en frumum er í hlutfallinu 2:1 (þetta var fengið með Agilent Bioanalyzer).

Niðurstöður rafdráttar RNA verða fyrir áhrifum af mörgum þáttum, þar á meðal aukabyggingu, rafskautsskilyrðum, sýnishleðslu, mettunarstig með EB o.s.frv. Notaðu innfædda rafdrætti til að greina RNA og notaðu DNA-merki sem stjórn.Ef 28S við 2kb og 18S við 0,9kb eru skýr, og 28S: 18S > 1, getur heilleikinn uppfyllt kröfur flestra síðari tilrauna.

A260/A280 er vísir sem hefur valdið miklum ruglingi.Fyrst af öllu er nauðsynlegt að skýra upprunalega merkingu þessa vísis fyrir kjarnsýrur: hreint RNA, A260/280 þess = um 2,0.Hreint RNA er 'orsökin' og A260/A280 = 2 er 'áhrifin'.Nú eru allir að nota A260/A280 sem „orsök“ og halda að „ef A260/A280 = 2, þá er RNA hreint“, sem leiðir náttúrulega til ruglings.

Ef þú hefur áhuga geturðu bætt smá hvarfefni sem er oft notað við útdrátt, eins og fenól, gúanidínísóþíósýanati, PEG o.s.frv., við RNA sýnishornið þitt og mælt svo hlutfallið A260/A280.Raunveruleikinn er sá að mörg hvarfefnanna sem notuð eru til RNA-útdráttar, sem og mörg óhreinindi í sýninu, gleypa í kringum A260 og A280, sem hafa áhrif á A260/A280.

Fróðlegasta aðferðin um þessar mundir er að skanna RNA sýni á bilinu 200-300 nm.Ferill hreins RNA hefur eftirfarandi eiginleika: ferillinn er sléttur, A230 og A260 eru tveir beygingarpunktar, A300 er nálægt 0, A260/A280 = um 2,0 og A260/A230 = um 2,0.Ef skannagögn eru ekki tiltæk verður einnig að ákvarða A260/A230 hlutfallið, þar sem þetta hlutfall er næmari fyrir flutningi allra óhreininda sem hafa áhrif á ensímhvarfið.Taktu tillit til línulegs sviðs tækisins (0,1–0,5 fyrir A260).

Það eru tvö önnur gagnleg fyrirbæri: hlutfallið verður um 0,3 lægra þegar A260/A280 er mælt í vatni;en hlutfallið sem mælt er í 10 mM EDTA er um 0,2 hærra en það sem mælist í 1 mM EDTA.

Skyldar vörur:

China Plant Total RNA Einangrunarsett Framleiðandi og birgir |Foregene (foreivd.com)

RNA einangrunarröð Birgir og verksmiðja |Kína RNA einangrunarröð Framleiðendur (foreivd.com)

RNA einangrunarröð – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)