RT-qPCR tilraun felur í sér RNA útdrátt og gæðamat, öfug umritun og qPCR þrjú skref, hvert skref hefur mikið af varúðarráðstöfunum, við munum kynna í smáatriðum hér að neðan.

Ⅰ.RNA gæðamat

Í RT-qPCR tilraun, eftir að RNA útdrætti er lokið, þarf að meta gæði RNA og eftirfylgni tilraunina er aðeins hægt að framkvæma eftir að hún er hæf.Matsaðferðir fela í sér litrófsmæli, Agilent gel rafdrætti, Agilent 2100 greiningu, þar á meðal algengasta litrófsmælirinn og agarósa gel rafdráttaraðferð.Það skal tekið fram að þessar tvær aðferðir þarf að nota saman til að ljúka greiningu og greiningu á RNA styrk, hreinleika og heilleika, til að tryggja gæði RNA.

Skylt RNA einangrunarsett: 

Cell Total RNA Einangrunarsett

Háhreinsað og hágæða heildar-RNA er hægt að fá úr ýmsum ræktuðum frumum á 11 mín.

Animal Total RNA einangrunarsett

Dragðu út háhreint og hágæða heildar-RNA á fljótlegan og skilvirkan hátt úr ýmsum dýravefjum.

Litrófsmælir:

Litrófsmælirinn er aðallega notaður til að ákvarða styrk og hreinleika RNA, en hann getur ekki greint heilleika RNA og erfðaefnaleifa.Meðal þeirra eru A260/280 og A260/230 mikilvægar breytur fyrir greiningu á hreinleika RNA og hægt er að greina RNA hreinleika í samræmi við sveiflur í gildi þeirra:

1. 1.9< A260/280< 2.1, sem gefur til kynna að RNA hreinleiki sé góður;A260/280<1,9, sem gefur til kynna að próteinleifar gætu verið í RNA;A260/280>2.1, sem gefur til kynna hugsanlegt niðurbrot RNA að hluta, sem hægt er að staðfesta frekar með rafdrætti á agarósageli.

2. 2.0< A260/230< 2.2, sem gefur til kynna að RNA hreinleiki sé góður;A260/230< 2,0, sem gefur til kynna að það geti verið leifar af lífrænum hvarfefnum í RNA, svo sem fenól, etanól eða sykur.

Agarósa hlaup rafskaut:

Agarose gel rafdráttargreining getur greint RNA heilleika, erfðamengi og próteinleifar, en getur ekki mælt nákvæmlega styrk RNA eða greint leifar lífrænna hvarfefna.Tökum heilkjörnunga RNA sniðmát sem dæmi:

1. RNA-efnið var sett í rafskaut með agarósageli.Ef það voru aðeins þrjár stakar bönd af 28sRNA, 18sRNA og 5.8sRNA á hlaupkortinu, gefur það til kynna að útdregna RNAið sé ósnortið.Ef það er dragandi fyrirbæri bendir það til niðurbrots RNA að hluta.

2. Ef það er eitt bjart band á milli límgatsins og 28sRNA bandsins, gæti verið erfðafræðilegt DNA leifar.

3. Ef bönd birtast í límgatinu gefur það til kynna að það geti verið leifar af próteini og öðrum stórsameindaefnum.

Ⅱ. Öfug umritun

Eftir að RNA útdrætti er lokið þarf að snúa því við í cDNA fyrir síðari tilraunir, þannig að viðsnúningsskrefið er nauðsynlegt.Öfug umritun verður kynnt úr vali á bakriti og primer:

Val á bakriti:

Dæmigerðir bakritar eru meðal annars AMV RTase og MMLV RTase.RNase H af AMV RTase hefur sterka virkni, stutta myndun lengd, lítið myndun magn og góðan hitastöðugleika (42 ~ 55 ℃).RNase H virkni MMLV RTase er veik, myndun lengd er löng, myndun magn er hátt og hitastöðugleiki er lélegur (37 ~ 42 ℃).

Þar sem RNase H ensím hefur það hlutverk að brjóta niður RNA sniðmát, ætti helst að velja MMLV með veika RNase H virkni við öfuga umritun og eftir síðari erfðatækni hefur hitastöðugleiki MMLV náð eigindlegu stökki.Að taka ForegeneForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV fyrir öfuga umritun) sem dæmi, það er nýr öfugur umskrift sem tjáður er í E. coli bakteríum með erfðafræðilegri endurröðunartækni.Það er raðbrigða DNA pólýmerasi sem býr til viðbótar DNA streng úr einþátta RNA, DNA eða RNA:DNA blendingi.Það hefur enga RNase H virkni, sterkan stöðugleika, sterka RNA sækni og mikið greiningarnæmi.

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV fyrir öfuga umritun)

Val á grunni:

Almennt falla RT primers í þrjá flokka: oligo dT, random primers og genasértæka primers.Veldu viðeigandi grunnur til notkunar í samræmi við mismunandi tilraunakröfur.

1. Ef sniðmátið er af heilkjörnungauppruna og seint cDNA er notað fyrir venjulega PCR mögnun, er mælt með Oligo (dT);Ef síðari tilraunin er aðeins notuð fyrir qPCR, er mælt með því að Oligo (dT) sé blandað saman við handahófskennda primera til að bæta skilvirkni öfugumritunar.

2. Ef sniðmátið er frá dreifkjörnungum ætti að velja Random Primera eða genasértæka primera fyrir öfuga umritun.

Ⅲ.qPCR

Flúrljómunarmagngreining er aðallega útfærð úr vali á megindlegum aðferðum, grunnhönnunarreglum, ROX vali, uppsetningu hvarfkerfis og stillingu hvarfskilyrða o.s.frv.

Val á megindlegum aðferðum:

Megindlegum aðferðum er skipt í hlutfallslegar megindlegar aðferðir og alger megindlegar aðferðir.Hægt er að nota hlutfallslega magngreiningu til að greina áhrif ákveðinna meðferðaraðferða á genatjáningu, greina mun á tjáningu gena á mismunandi tímum og bera saman mun á tjáningu gena í mismunandi vefjum.Alger magngreining getur greint magn kjarnsýru í veirunni og svo framvegis.Þegar við gerum tilraunir verðum við að velja viðeigandi megindlegar aðferðir í samræmi við okkar eigin tilraunir.

Grunnhönnunarreglur:

Hönnun primer fyrir qPCR er í beinu samhengi við mögnunarvirkni og vörusérhæfni.Þess vegna er rétt hönnun góðra grunna fyrsta skrefið í árangursríkri qPCR.Við hönnun grunns ætti að huga að eftirfarandi meginreglum þegar farið er að meginreglunni um hefðbundna grunnhönnun:

1. Lengd markhlutans er stjórnað á milli 100 og 300 bp;

2. Cross-exon hönnun til að forðast áhrif erfðafræðilegs DNA;

3. Prófa þarf hönnuð primerana með tilliti til mögnunarvirkni og aðeins þegar mögnunarvirknin nær staðlinum (90-110%) er hægt að nota þá fyrir magntilraunir;

4. Grunnstyrkur er venjulega fínstilltur á milli 0,1uM og 1,0uM.

Úrval afROX:

Í magnhvarfsferlinu getur ROX stillt sjónleiðarmuninn, pípusetningarvillu eða rúmmálsmun sem stafar af uppgufun og þéttingu jafnt og þétt, sem bætir endurtekningarhæfni niðurstaðna.Hins vegar skal tekið fram að valið á ROX tengist tækinu.Ef qPCR tækið hefur það hlutverk að leiðrétta sjálfkrafa muninn á holum, þarf það ekki að bæta við ROX;annars þarf það að bæta við ROX leiðréttingu.Litlir samstarfsaðilar við að kaupa hvarfefni verða að vera í samræmi við tækið sem notað er til að velja rétta ROX, forðast síðar mistök.

Undirbúningur viðbragðskerfis:

Hvarfmagn 20 µl og 50 µl er æskilegt.Við mótun kerfisins ber að huga að eftirfarandi atriðum:

1. Viðbragðskerfið þarf að undirbúa með loftræstingu í ofurhreinum vinnubekknum, nýjum ddH₂O er notað fyrir hverja tilraun;

2. Hver tilraun þarf að undirbúa NTC til að sannreyna hvort það sé mengun í kerfinu og hvert par af primers þarf að gera NTC þegar kerfið er undirbúið;

3. Til að greina hvort það er gDNA leifar í RNA sniðmátinu er hægt að útbúa NRT fyrir hvert sýni til greiningar;

4. Þegar kerfið er undirbúið er mælt með að gera að minnsta kosti 3 tæknilegar endurtekningar fyrir eitt sýni;

5. Þegar sniðmátið er cDNA er mælt með því að þynna 5-10 sinnum til að draga úr hindrunaráhrifum öfugt umritunarkerfis á qPCR tilraun.Það er betra að kanna sniðmátsmagnið eftir halla, þannig að CT gildið falli á milli 20-30;

6. Ákvarða þarf fjölda viðbragða, aukið um 5-10% á grundvelli fjölda viðbragða og reiknið út rúmmálsstillingarnúmerið;

7, kerfið er undirbúið með forblöndunarreglunni, blandað eftir skilvindu og tryggt að engar loftbólur;

8, Eins langt og hægt er að velja stuðningsvörur.

Tengt RT-qPCR Kit