Sérhæfni uppgötvunar
Í flestum tilfellum er tilgangur grunnhönnunar að hámarka sértækni PCR.Þetta ræðst af meira eða minna fyrirsjáanlegum áhrifum margra breyta.Ein mikilvæg breyta er röðin í 3′enda grunnsins.
Mikilvægt er að PCR-próf sem eru hönnuð fyrir sérhæfni eru líklegri til að viðhalda mikilli skilvirkni á breitt hreyfisvið, vegna þess að greiningin framleiðir ekki ósérhæfðar mögnunarafurðir og keppir þar með við PCR-hvarfefni eða hindrar aðalmögnunarviðbrögðin.
Auðvitað er sérhæfni í sumum tilfellum ekki mikilvægust, til dæmis þegar markmiðið er að mæla náskylda en mismunandi sýkla, sérstaka hönnun, hagræðingu og sannprófunarstaðla.
Bræðsluferillinn er stöðluð aðferð til að meta sérhæfni amplicons, að minnsta kosti með tilliti til þess hvort magna eigi upp eitt mark.Hins vegar verður að leggja áherslu á að bræðsluferlar geta verið villandi vegna þess að þeir geta til dæmis orðið fyrir áhrifum af samsettum áhrifum óákjósanlegra grunna og lágs sniðmátstyrks.
P5 |Bræðsluferillinn sýnir Tm breytingar sem fást við tvær greiningar á mismunandi magni tveggja mark-DNA.
A. Við hærri styrk (ad) er engin augljós primer dimer eftir að qPCR mælingu er lokið.Þegar sniðmátsstyrkurinn minnkar í 50 eintök (e), byrjar ósértæk vara að birtast og verður eina varan með lægsta styrkinn (f).
B. Prófið skráði sama Tms í öllum markstyrkjum og það var enginn augljós primer dimer jafnvel við lægsta styrk (5 eintök).Þegar þessar tvær greiningaraðferðir voru notaðar greindust engar mögnunarafurðir í NTC.
P5 sýnir upplausnarferlurnar sem fengust með sýnum þar sem sniðmátið er til staðar í mismunandi styrk.P 5a sýnir að við tvo lægstu styrkleikana eru Tms ósértæku mögnunarafurðanna sem framleiddar eru lægri en hjá sértæku mögnunum.
Augljóslega er ekki hægt að nota þessa greiningaraðferð á áreiðanlegan hátt til að greina skotmörk sem eru til í lágum styrk.
Athyglisvert er að NTC, þ.e. sýni með alls ekkert DNA, skráðu ekki (ósérhæfðar) mögnunarafurðir, sem gefur til kynna að bakgrunnserfðafræðilegt DNA geti tekið þátt í ósértækri mögnun/fjölliðun.
Stundum er ekki hægt að ráða bót á slíkum bakgrunnsprimerum og ósértækri mögnun, en oft er hægt að hanna greiningaraðferð sem hefur ekki ósértæka mögnun í neinum sniðmátstyrk og NTC (P 5b).
Hér mun jafnvel skráning á mögnun markstyrksins með Cq upp á 35 framleiða ákveðna upplausnarferil.Á sama hátt sýndu NTC engin merki um ósértæka mögnun.Stundum getur greiningarhegðun verið háð móðurvökvanum og aðeins ósértæk mögnun greinist í ákveðnum stuðpúðasamsetningum, sem getur tengst mismunandi Mg2+ styrk.
Stöðugleiki uppgötvunar
Hagræðing Ta er gagnlegt skref í reynslusannprófun og hagræðingarferli qPCR uppgötvunar.Það gefur beina vísbendingu um styrkleika grunnsettsins með því að sýna hitastigið (eða hitastigið) sem framleiðir lægsta Cq án þess að magna upp NTC.
Tvö til fjórfaldur munur á næmi skiptir kannski ekki máli fyrir fólk með mikla mRNA tjáningu, en fyrir greiningarpróf getur það þýtt muninn á jákvæðum og fölskum neikvæðum niðurstöðum.
Ta eiginleikar qPCR primers geta verið mjög mismunandi.Sumar prófanir eru ekki mjög öflugar og ef þær eru ekki gerðar undir ákjósanlegu Ta-gildi primeranna munu þær fljótt hrynja.
Þetta er mikilvægt vegna þess að þessi tegund af uppgötvun er oft erfið í hinum raunverulega heimi og hreinleiki sýnisins, styrkur DNA eða tilvist annars DNA gæti ekki verið ákjósanlegur.
Þar að auki getur markfjöldi eintaks verið breytilegur og hvarfefnin, plastáhöldin eða tækin geta verið önnur en þau sem notuð eru við uppsetningu prófsins.
P6|Hitastigshlutfallið sýnir mismunandi styrkleika PCR uppgötvunar.
A. Notaðu Sensifast SYBR mastermix frá Bioline (verslunarnúmer BIO-98050) til að framkvæma PCR á cDNA sem er búið til úr RNA í heila manna.
B. Notaðu CFX qPCR tæki frá Bio-Rad til að skrá mögnunarkortið og upplausnarferil apalens (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
C. Mögnunargraf og bræðsluferill ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. Mögnunargraf og upplausnarferill GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).
E. Cqs skráð við mismunandi útgræðsluhitastig, sem sýnir muninn á Cq skráð undir 7C hitastig.
P 6 sýnir dæmigerða niðurstöðu óæskilegrar prófunar, þar sem qPCR var framkvæmt með því að nota halla Tas á milli 59C og 67C (P 6a), með því að nota primera fyrir þrjú heilasértæk gen.
Það má sjá á mögnunargrafinu að Opalin primers eru langt frá því að vera tilvalin vegna þess að ákjósanlegasta Ta svið þeirra er mjög þröngt (Mynd 6b), það er Cqs eru víða dreifðir, sem leiðir til þess að Cqs eru marktækt borin saman við ákjósanlegasta Cqs Low.
Þessi greiningaraðferð er óstöðug og getur leitt til óhagkvæmrar mögnunar.Þess vegna ætti að endurhanna þetta grunnpar.Að auki sýnir bræðsluferillinn (innfelling) að sérhæfni þessarar greiningaraðferðar getur einnig verið erfið, vegna þess að bræðsluferill hvers Ta er mismunandi.
ACSBG1 greiningaraðferðin sem sýnd er í P 6c er öflugri en Opalin greiningaraðferðin hér að ofan, en hún er samt langt frá því að vera tilvalin og líklegt er að hægt sé að bæta hana.
Hins vegar leggjum við áherslu á að engin nauðsynleg tenging sé á milli styrkleika og sértækni, vegna þess að upplausnarferillinn sem framleiddur er með þessari greiningaraðferð sýnir sama hámarksgildi í öllum Tas (innfelling).
Á hinn bóginn er styrkleikaprófið mun umburðarlyndara og framleiðir svipaðar Cqs í fjölmörgum Tas, eins og í GFAP prófinu sem sýnt er í P 6d.
Munurinn á Cqs sem fæst á sama 8 gráðu celsíus bilinu er minni en 1 og upplausnarferillinn (innfelldur) staðfestir greiningareiginleikana á þessu hitastigi.Það er athyglisvert að reiknað Tas og raunverulegt Ta svið geta verið mjög mismunandi.
Það eru til margar leiðbeiningar sem ætlað er að hjálpa rannsakendum að hanna skilvirka grunna, sem flestar eru byggðar á löngu viðurkenndum reglum og mikil athygli hefur verið lögð á 3′enda grunnanna.Oft er mælt með því að hafa G eða C í 3' endanum og tvo G eða C basa (GC klemma), en ekki fleiri en tveir af síðustu 5 basunum.
Í reynd geta þessar reglur leiðbeint rannsakendum en þær eru ekki endilega réttar undir öllum kringumstæðum.
P7 |3′endinn á grunninum hefur lítil áhrif á sérhæfni eða skilvirkni.
A. Staða frumra fyrir HIF-1α (NM_181054.2) genið úr mönnum.
B. Notaðu Agilent Brilliant III SYBR grænt móðurvín (Vörunúmer 600882) til að magna upp sex prófunaratriði.
C. Mögnunargraf og bræðsluferill skráð með Bio-Rad CFX qPCR tækinu og 3′enda primers.NTC eru sýnd með rauðu.
D. Cqs skrá yfir hvert próf atriði
Til dæmis, niðurstaðan í P 7 stangast á við 3′enda regluna.Öll hönnun skilar í grundvallaratriðum sömu niðurstöðum, með aðeins tvær grunnsamsetningar sem leiða til ósértækrar mögnunar í NTC.
Hins vegar getum við ekki stutt áhrif GC klemmunnar, vegna þess að í þessu tilviki dregur það ekki úr sérhæfni að nota A eða T sem hámark 30 basa.
Próf C, þar sem F grunnurinn endar á GGCC, skráði Cqs í NTC, sem gefur til kynna að maður gæti viljað forðast þessar raðir í 30-endanum.Við leggjum áherslu á að eina leiðin til að ákvarða bestu 3'enda rununa af grunnpari er að meta suma frumefnisframbjóðendur með tilraunum.
Afköst mögnunar
Mikilvægt er, þó að ósértæk PCR uppgötvun geti aldrei orðið sértæk, er hægt að stilla og hámarka mögnunarvirknina á marga mismunandi vegu með því að breyta ensíminu, móðurvíninu, aukefnum og hringrásaraðstæðum.
Til að meta skilvirkni PCR uppgötvunar er best að nota raðþynningu sem er 10 eða 5 sinnum markkjarnasýran, það er „staðlaða ferilaðferðin“.
Ef PCR amplicons eða tilbúið DNA mark eru notuð til að búa til staðlaða feril, skal blanda raðþynningum þessara marka saman við stöðugt magn af bakgrunns DNA (svo sem erfðafræðilegt DNA).
P8 |Þynningarferill til að meta skilvirkni PCR.
A. Notaðu grunna fyrir HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA og R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC og Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (verslunarnúmer 600882) fyrir PCR og bræðsluferilskilyrði.
B. 100 ng RNA var öfugt umritað, þynnt 2 sinnum og raðþynnt cDNA sýni voru þynnt 5 sinnum í 1 ng erfðaefnis DNA úr mönnum.Bræðsluferillinn er sýndur í innskotinu.
C. RT hvarfið, þynningin og raðþynningin voru endurtekin fyrir annað cDNA sýnið og niðurstöðurnar voru svipaðar.
P 8 sýnir tvær staðlaðar línur, þar sem sömu greiningaraðferð er notuð á tveimur mismunandi cDNA sýnum, niðurstaðan er sama skilvirkni, um 100%, og R2 gildið er líka svipað, það er að segja hversu vel er á milli tilraunagagnanna og aðhvarfslínunnar eða gagna Línuleikastigs.
Stöðluðu ferlurnar tvær eru sambærilegar, en ekki nákvæmlega eins.Ef tilgangurinn er að mæla markið nákvæmlega verður að taka fram að það er óviðunandi að gefa upp afritatöluútreikning án þess að útskýra óvissuna
P9 |Mælingaóvissa sem tengist magngreiningu með því að nota staðlaðan feril.
A. Notaðu grunna fyrir GAPDH (NM_002046) til að framkvæma PCR og bræðsluferilskilyrði.F: ACAGTTGCCATGTAGACC og R: TAACTGGTTGAGCACAGG og Bioline's Sensifast SYBR mastermix (verslunarnúmer BIO-98050).
B. Mögnunarkort, bræðsluferill og staðalferill skráð með CFX qPCR tæki frá Bio-Rad.
C. Staðlað ferilgraf og 95% öryggisbil (CI).
D. Fjöldi afrita og 95% öryggisbil Cq-gildanna þriggja sem fengin eru úr þynningarferlinu.
P 9 sýnir að fyrir fínstillt próf er eðlislægur breytileiki eins staðalferils um það bil 2 sinnum (95% öryggisbil, lágmark til hámark), sem getur verið minnsti breytileiki sem hægt er að búast við.
Tengd vara:
Birtingartími: 30. september 2021
