Allir eru að tala um meginregluna um qRT-PCR tilraun, grunnhönnun, niðurstöðutúlkun o.s.frv., en ég held að ég ætti að deila með þér tilraunastarfsemi qRT-PCR.Það er lítið, en það snýst um árangur.
Áður en við gerum qRT-PCR þurfum við að hafa skýran skilning á okkar eigin RNA og aðgerðaaðferðum.Þegar öllu er á botninn hvolft miðar viðleitni okkar að því að ná árangri, frekar en að æfa sig.Svo áður en við gerum qRT-PCR þurfum við að ákvarða eftirfarandi atriði (sum þeirra eiga aðeins við um SYBR).
1 Ertu viss um að RNA þitt sé ekki brotið niður?
NanoDrop 2000 getur aðeins greint styrk og hreinleika RNA, en getur ekki greint heilleika RNA.
RNA (RNA Insity Number) gildið getur endurspeglað heilleika RNA, sem er greint með Agilent 2100 lífgreiningarkerfinu.
Mynd. Skýringarmynd af RIN-gildum fyrir mismunandi RNA sýni (hkjörnunga)
Hins vegar hafa rannsóknarstofur almennt ekki Agilent 2100 lífgreiningartæki.Í þessu tilviki getum við greint í gegnum formaldehýð hlaup, en krafan um heildarmagn RNA er mikil, þannig að fljótlegasta aðferðin er að nota venjulega hlaup rafskaut.Það þarf að vera í kjarnalausu umhverfi, svo það er nauðsynlegt að skola rafskautstankinn, sólflöskuna, hlaupfestinguna og greiða með DEPC vatni.Agarósan er líka kjarnalaus (svo lengi sem hann er nýopnaður) og hleðslubuffinn ætti að vera nýopnaður eins mikið og mögulegt er, með 1,2% hlaupi.
Athugið að hlaupið verður að vera alveg uppleyst, annars veldur það ójöfnum böndum, eins og sýnt er í sýni 9 á myndinni.Ef spennan er of há eða í gangi of lengi mun það mynda hita og valda niðurbroti RNA, þannig að spennu og tíma ætti að vera stjórnað á sanngjarnan hátt.Að auki getur hlauphlaup einnig ákvarðað frekar hvort DNA-leifar séu í sýninu og fylgst með því hvort það sé mikill fjöldi geymdra bönda í skömmtunarholunni.
Mynd.Gel rafdráttargreining á RNA
2 Ertu viss um styrk cDNA þíns?
Reynsla stóru bræðranna á rannsóknarstofunni er sú að cDNA 20 ul kerfisins sem fæst við hverja öfugsnúningu er beint þynnt 20X, en eftirdoktorssysturnar eru þynntar 10X.Ég fer yfirleitt eftir aðstæðum.Vegna þess að gæði RNA sem hver einstaklingur nefnir eru mismunandi, er stig viðsnúnings einnig mismunandi og viðsnúningur tæknin gæti ekki verið stöðug.
Þannig að í hvert skipti sem ég fæ snúið cDNA, mun ég fyrst þynna það um það bil 3 sinnum, og nota síðan stofugenið til að gera RT-PCR, fjöldi lota er almennt 25 lotur, til að bera kennsl á sérstakan styrk og ákvarða síðan endanlega þynningarstuðulinn.
3 Ertu viss um að primerarnir þínir séu auðveldir í notkun?
Það getur staðist bræðsluferil qRT-PCR, en þetta kostar samt peninga.Fyrir rannsóknarstofur sem eru án mikillar peninga, þegar þær fá mikið af primerum, geta þær notað venjulegt RT-PCR til að sjá hvort það sé eitt band og auðkennt sérhæfni primeranna.Ef rannsóknarstofan skortir ekki peninga er hægt að bera kennsl á sérhæfni allra grunna einu sinni í gegnum bræðsluferilinn.
4 Ertu viss um að tilraunaaðstæður þínar henti?
SYBR ætti að vera varið gegn sterku ljósi, svo reyndu að slökkva á loftljósinu þegar þú bætir við SYBR hvarfefni og þarft aðeins að nota dauft ljós til að klára það.
Geymið SYBR við 4°C.Þegar þú ert í notkun skaltu hvolfa varlega upp og niður til að blanda vel til að forðast froðumyndun og ekki hringiða kröftuglega.
Sumum yngri systrum finnst gaman að teikna merki á PCR borðið af ótta við að blanda saman sýnunum, sem er rangt.Vegna þess að merki þín eru mjög líkleg til að hafa áhrif á söfnun flúrljómandi merkja, mæli ég almennt með því að unglingar noti tilraunabækur til að aðstoða við minnið, eins og sýnt er hér að neðan.
Mynd.qRT-PCR sýnishleðslumynd
5 Ertu viss um að þú sért að gera það rétt?
Vertu viss um að vera með hanska, vera með hanska, vera með hanska og segja mikilvæga hluti þrisvar sinnum.
Til að draga úr útsetningu SYBR fyrir ljósi finnst mér persónulega gott að bæta við sniðmáti fyrst, eins og sýnt er á myndinni hér að neðan.Samkvæmt reynslunni er líklegt að það að bæta við litlu magni af sniðmáti valdi sýnatökuvillum.Þess vegna, til þess að lágmarka villuna sem stafar af því að bæta við litlu magni af sniðmáti, tvöfalda ég venjulega sýnishornið aftur og tvöfalda magnið þegar sýninu er bætt við til að minnka magn H2O2 sem bætt er við.
Mynd.Skýringarmynd af qRT-PCR hleðslu
Stilltu síðan qRT-PCR kerfið sem hér segir.
Mynd.qRT-PCR kerfi undirbúningsmynd
ATH: Stillingarferlið þarf að fara fram á ís.
Eftir að sýninu hefur verið bætt við skaltu líma gegnsæju þéttifilmuna.Reyndu að snerta ekki yfirborð gagnsæu þéttifilmunnar með höndum þínum, notaðu bara úr rýminu á báðum hliðum filmunnar.Vegna þess að fingraför geta einnig haft áhrif á söfnun flúrljómandi merkja.Notaðu síðan skilvindu til að skilvindu fljótt í 10 sekúndur á lágum hraða til að koma í veg fyrir að sýnið hengi á vegginn.
Skyldar vörur:
Birtingartími: 28. apríl 2023
