RT-qPCR er grunntilraun sameindalíffræði og allir verða að kannast við hana.Það felur aðallega í sér þrjú skref: RNA útdrátt, öfug umritun í cDNA og rauntíma flúrljómandi magn PCR.Það hjálpar ekki, hvað er í gangi?Það er líklegt að það sé vandamál meðöfugri umritunartilraunina!Þó svo virðist sem öfug umritunartilraunin þurfi aðeins að bæta við RNA, dNTP, frumurum ogöfugur umskriftí skilvindurörið og blandið vel saman, en í raunvinnsluferlinu eru enn mörg smáatriði sem þarf að huga að.Við skulum læra um það!

Hvernig á að dæma gæði RNA?
Til að fá cDNA eru gæði RNA mikilvæg!RNA gæði má greina aðallega frá tveimur þáttum:
(1) RNA heilleiki:RNA heilleika er hægt að sannreyna með agarósa gel rafdrætti. Ef þú tekur heilkjörnunga sem dæmi, þá hefur heildar-RNA-efnið þrjú skýr bönd, mólþunginn frá stórum til lítillar er 28S, 18S og 5S, og 28S er tvöfalt bjartari en 18S;ef hægt er að sjá þrjár bönd, en bandgerðin er óskýr eða Diffusion þýðir að RNA er niðurbrotið að hluta.Á þessum tíma, vinsamlegast framkvæmið öfug umritunarviðbrögð strax og aukið sniðmátinntakið á viðeigandi hátt;ef aðeins er hægt að sjá band með litla mólþunga eða ekkert band hefur RNA verið alveg niðurbrotið og þarf að draga það út aftur.Agilent 2100 gefur til kynna heilleika RNA með hámarksmynd og RIN gildi.Ef kjarnsýran er ósnortinn er grunnlína rafskautsins flöt;ef kjarnsýran er alvarlega niðurbrotin er grunnlínan ójöfn og fleiri niðurbrotstoppar koma fram;gildi RIN endurspeglar heilleika RNA, á bilinu 0-10, því hærra sem gildið er, því betri gæði RNA.Jæja, því hærra sem heill er.
(2) Hreinleiki RNA:Hlutfallið OD260/280 er hægt að greina með UV litrófsmælingu.Ef hlutfall OD260/280 er á milli 1,9 og 2,1 er hreinleikinn mjög góður.
Erfðafræðilegt DNA sem eftir er getur leitt til ónákvæmra megindlegra niðurstaðna
Þegar RNA er dregið út getur RNA sem við fáum verið blandað saman við erfðafræðilegt DNA (gDNA) sem hefur ekki verið hreinsað upp.Þess vegna verður cDNA eftir öfuga umritun einnig blandað saman viðgDNA.Á meðan á niðurstreymi stendurqPCRviðbrögð,cDNAog gDNA getur verið magnað samtímis, sem leiðir til tiltölulega lítið CT gildi, þannig að niðurstöðurnar gætu verið hlutdrægar.
Svo hvað ættum við að gera í þessari stöðu?Foregeneleggur til:
(1) Framkvæma erfðamengishreinsun á öfugum RNA, sem hægt er að fjarlægja með súluútdrætti meðan á RNA útdrætti stendur;
(2) Meðhöndlaðu útdregna RNA með DNaseI , en slíta því með EDTA;
af öfugumritunarhvarfefnummeð erfðamengihreinsunareiningum;

Hvernig á að velja primera fyrir öfuga umritun?
Reverse umritun primers hafa einnig áhrif á niðurstöðu öfugumritunarviðbragða.Þú getur valið handahófskennda primera, Oligo dT eða genasértæka primera fyrir öfuga umritun í samræmi við sérstakar aðstæður tilraunarinnar:
(1) Sérstök afrit: Mælt er með genasértækum primers;
(2) Löng brotaafrit: Mælt er með Oligo dT/gen-sértækum primers;
(3) Innri brot af langþráðum afritum: genasértækir primers/ random primers/random primers + Oligo dT.Ef síðari qPCR tilraunin er gerð, er ekki hægt að nota Oligo dT eitt sér, vegna þess að notkun Oligo dT eitt sér getur valdið 3′ enda skekkju, sem leiðir til ónákvæmra qPCR tilrauna niðurstöður;
(4) míRNA: Hægt er að nota stofnlykkja primera eða tailing primera.

Hversu oft ætti að þynna öfugumritunarafurð cDNA til magngreiningar?
Eftir að hafa fengið cDNA öfugumritunarafurðarinnar er mjög mikilvægt hversu oft cDNA ætti að þynna út fyrir qPCR tilraunir.Ef cDNA styrkurinn er of hár eða of lágur getur mögnunarvirknin haft áhrif á það.Er hægt að mæla styrk cDNA og hvernig ætti að gera það?
(1) Ekki er hægt að mæla cDNA styrk öfugumritunarafurðarinnar, vegna þess að auk cDNA afurðarinnar inniheldur öfugumritunarafurðin einnig öfugumritunarleifar Buffer, öfugt umritunarefni, primera o.s.frv., sem mun trufla styrk mælingarniðurstöðurnar og valda OD260/280, OD300/hlutfallið endurspeglar því ekki cD260/eðlilegt.Á þessum tíma munu sumir vinir segja, þá mun ég mæla styrkinn eftir hreinsun;Hér vill Foregene minna á að ekki er mælt með því að cDNA sé hreinsað, vegna þess að lengd cDNA sem fæst við viðsnúninginn er mismunandi og stutta cDNA tapast í hreinsuninni.
(2) Svo hvað á að gera?Fyrir qPCR tilraunina er hægt að ákvarða þynningarstig cDNA með fortilrauninni.Til dæmis: notaðu cDNA stofnlausn, 10-falda þynningu og 100-falda þynningu sem sniðmát fyrir qPCR tilraunir og veldu þynningarstuðulinn með CT-gildi á bilinu 18-28.

Hvernig ætti að umrita miRNA í öfugum stíl?
miRNA er einþátta lítil sameind RNA með stærð um það bil 22 nt sem kóðar ekki fyrir prótein.Vegna stuttrar lengdar er hefðbundin qPCR aðferð erfitt að mæla hana beint, svo það er oft nauðsynlegt að lengja miRNA;algengustu öfugumritunaraðferðirnar fyrir miRNA innihalda stofnlykkjaaðferð og skottaðferð.
Stofnlykkjaaðferðin er að lengja miRNA með því að bæta við stofnlykkja grunni.Þessi greiningaraðferð hefur hærra næmni og sérhæfni, en greiningarafköst er lágt.Ein öfug umritun getur aðeins greint eitt miRNA og innri tilvísun;halabætandi aðferðin samanstendur af tveimur. Hún er fullgerð með sameiginlegri virkni tveggja ensíma, sem eru PolyA pólýmerasi og bakrit.PolyA pólýmerasi er ábyrgur fyrir því að bæta PolyA hala við miRNA til að auka lengd þess og öfug umritun framkvæmir öfug umritunarviðbrögð.Þessi aðferð hefur mikla greiningargetu og getur greint mörg miRNA og innri tilvísanir í einni öfugri umritun, en næmni og sértækni er lítil í stofnlykkjaaðferðinni.