Í qPCR tilraunum er grunnhönnun einnig mjög mikilvægur hlekkur.Hvort primerarnir eru hentugir eða ekki er nátengt því hvort mögnunarvirknin nái viðmiðinu, hvort mögnuðu afurðirnar séu sértækar og hvort tilraunaniðurstöður séu tiltækar.
Svo hvernig á að gera qPCR grunnsérhæfni betri?Mikil mögnunarvirkni?
Í dag munum við taka þig til að hanna qPCR primera saman og láta qPCR primer hönnun verða skilvirk fræðikunnátta í tilraunum.
Þegar qPCR primers eru hannaðir, skal yfirleitt fylgjast með eftirfarandi atriðum: primera ætti að vera hannað þvert á innröng eins mikið og mögulegt er, lengd afurðarinnar ætti að vera 100-300 bp, Tm gildið ætti að vera sem næst 60°C og upstream og downstream primers ættu að vera eins nálægt og hægt er og endir primersins ætti að vera G C, o.s.frv.
1. Hönnun grunna sem spanna innra
Þegar qPCR primers eru hannaðir getur valið á primers hönnuðum þvert á introns komið í veg fyrir að gDNA sniðmátið sé mögnuð og afurðirnar eru allar fengnar úr mögnun cDNA og þannig útilokað áhrif gDNA mengunar.
2. Grunnur lengd
Grunnlengdin er yfirleitt á milli 18-30 nt og lengd mögnunarafurðarinnar ætti að vera stjórnað á milli 100-300 bp eins mikið og mögulegt er.
Ef grunnurinn er of stuttur mun hann leiða til ósértækrar mögnunar og ef hann er of langur myndar hann auðveldlega aukabyggingu (eins og hárnálabyggingu).Ef mögnunarafurðin er of löng er hún ekki hentug fyrir hvarf fjölliða, sem mun hafa áhrif á skilvirkni PCR mögnunar.
3. GC innihald og Tm gildi
GC innihald primers ætti að vera stjórnað á milli 40% og 60%.Ef það er of hátt eða of lágt er það ekki til þess fallið að hefja viðbrögðin.GC innihald fram- og afturábaks grunnsins ætti að vera nálægt því sama til að fá sama Tm-gildi og glæðingarhitastig.
Tm gildið ætti að vera á bilinu 55-65°C eins langt og hægt er, yfirleitt um 60°C, og Tm gildi andstreymis og niðurstreymis ætti að vera eins nálægt og hægt er, helst ekki meira en 4°C.
4. Forðastu að velja A í 3′ enda grunnsins
Þegar 3′ endinn á grunninum er missamur er mikill munur á nýmyndun mismunandi basa.Þegar síðasti basinn er A getur hann einnig komið af stað keðjumyndun jafnvel ef um missamsetningu er að ræða, og þegar síðasti basinn er T When , minnkar skilvirkni ósamræmisframköllunar verulega.Reyndu því að forðast að velja A í 3′ enda grunnsins og þá er betra að velja T.
Ef það er rannsaka grunnur, getur 5′ endi rannsakans ekki verið G, því jafnvel þegar einn G basi er tengdur við FAM flúrljómandi skýrsluhópinn, getur G einnig slökkt á flúrljómunarmerkinu sem FAM hópurinn gefur frá sér, sem leiðir til rangra neikvæðra niðurstaðna.Birtast.
5. Grunndreifing
Dreifing basanna fjögurra í grunninum er helst tilviljunarkennd, forðast fleiri en 3 G eða C í röð í 3′ endanum og fleiri en 3 í röðG eða C er auðvelt að búa til pörun á GC-ríku raðsvæðinu.
6. Grunnhönnunarsvæðið ætti að forðast flókin aukamannvirki.
Auka uppbyggingin sem myndast af einum þræði mögnunarafurðarinnar mun hafa áhrif á hnökralausa framvindu PCR.Með því að spá fyrir um hvort það sé aukabygging í markröðinni fyrirfram, reyndu að forðast þetta svæði við hönnun primers.
7. Primerarnir sjálfir og á milli primeranna ættu að reyna að forðast samfellda viðbótarbasa.
Það getur ekki verið samfelld 4 basa fylling á milli grunnsins sjálfs og grunnsins.Grunnurinn sjálfur ætti ekki að hafa viðbótarröð, annars mun hann brjóta sig saman og mynda hárnálabyggingu, sem hefur áhrif á glæðingarsamsetningu grunnsins og sniðmátsins.
Viðbótarraðir geta ekki verið á milli andstreymis og downstream primers.Fylling milli primera mun framleiða primer dimera, sem mun draga úr PCR skilvirkni og jafnvel hafa áhrif á magnnákvæmni.Ef primer-dimer og hárnálarbyggingin er óhjákvæmileg, ætti △G gildið ekki að vera of hátt (ætti að vera minna en 4,5 kcal/mól).
8. Primerarnir magna upp markvissu vöruna.
Endanlegt markmið qPCR uppgötvunar er að skilja gnægð markgensins.Ef ósértæk mögnun á sér stað verður magngreiningin ónákvæm.Þess vegna, eftir að primerarnir eru hannaðir, þarf að prófa þá með BLAST og sérhæfni afurðanna er borin saman í raðgagnagrunninum.
Næst tökum við mannlegt GAS6 (Growth arrest specific 6) gen sem dæmi til að hanna qPCR primera.
01 fyrirspurnargen
Homo GAS6í gegnum NCBI.Hér ættum við að huga að því að bera saman genaheitið og tegundina til að tryggja að þau séu í samræmi.
02 Finndu genaröðina
(1) Ef markröðin er erfðafræðilegt DNA, veldu þá fyrstu, sem er erfðafræðileg DNA röð gensins.
(2) Ef markröðin er mRNA, veldu þá seinni.Eftir að þú hefur slegið inn skaltu smella á „CDS“ í töflunni hér að neðan.Brúna bakgrunnsröðin er kóðaröð gensins.
03 Hönnunargrunnur
Farðu inn í Primer-BLAST viðmótið
Sláðu inn raðnúmer gena eða röðina á Fasta sniði efst til vinstri og fylltu út viðeigandi færibreytur.

Smelltu á „Fá primers“ og NCBI mun skjóta upp kollinum til að segja þér að slíkt færibreytuval verði magnað upp í önnur splæsingarafbrigði.Við getum athugað mismunandi splæsingarafbrigði og sent þau til að fá viðeigandi grunnpar (eins og sýnt er á myndinni hér að neðan).Þetta ferli getur tekið tugi sekúndna að keyra.
Hitastig þessara grunnpara er allt í kringum 60°C.Í samræmi við tilgang tilraunarinnar skaltu velja primera með miðlungs lengd, góða sértækni og minni sjálfsuppfyllingu primers fyrir tilraunina og árangurinn er nokkuð hár!
04Primer sérhæfni sannprófun
Reyndar, auk þess að hanna grunna, getur Primer-Blast einnig metið grunnana sem við hönnuðum sjálf.Farðu aftur á primer hönnunarsíðuna, sláðu inn andstreymis og downstream grunninn sem við hönnuðum og aðrar breytur verða ekki lagaðar.Eftir að hafa sent inn geturðu séð hvort primerparið sé einnig til á öðrum genum.Ef þau eru öll sýnd á geninu sem við viljum magna upp, sem gefur til kynna að sérhæfni þessa primerapars sé frábær!(Til dæmis er þetta eina niðurstaða grunnfyrirspurnarinnar!)

05 Grunnur gæðadómur
Hvers konar grunnur er „fullkominn“ grunnurinn sem sameinar „mögnunarnýtni upp að stöðluðu“, „magnaða vörueiginleika“ og „áreiðanlegar tilraunaniðurstöður“?
Afköst mögnunar

bræðsluferill
Mögnunarnýting primeranna nær 90%-110% sem þýðir að mögnunarnýtingin er góð og bræðsluferillinn hefur einn topp og venjulega Tm>80°C sem þýðir að mögnunarsértæknin er góð.
 
Skyldar vörur:
Rauntíma PCR Easy–SYBR GREEN I
Rauntíma PCR Easy-Taqman