Fluorescence quantitative PCR (einnig þekkt sem TaqMan PCR, hér eftir nefnt FQ-PCR) er ný kjarnsýra megindleg tækni þróuð af PE (Perkin Elmer) í Bandaríkjunum árið 1995. Þessi tækni byggir á hefðbundnum PCR með því að bæta við flúrljómandi merktum skyndi.Í samanburði við sveigjanlegan PCR hefur FQ-PCR marga kosti til að átta sig á megindlegri virkni þess.Þessi grein ætlar að lýsa í stuttu máli eiginleikum, meginreglum, aðferðum og notkun tækninnar.
1 Eiginleikar
FQ-PCR hefur ekki aðeins mikla næmni venjulegs PCR, heldur einnig vegna notkunar flúrljómunarnema, getur það beint greint breytingu á flúrljómandi merkjum við PCR mögnun í gegnum ljósleiðnikerfið til að fá magnbundnar niðurstöður, sem sigrast á mörgum göllum hefðbundins PCR, þannig að það hefur einnig mikla sértækni blendingartækni og mikla sértækni DNA.
Til dæmis þarf að fylgjast með almennum PCR vörum með rafdrætti á agarósahlaupi og litun á etídíumbrómíði með útfjólubláu ljósi eða með rafskaut með pólýakrýlamíðhlaupi og silfurlitun.Þetta krefst ekki aðeins margra tækja heldur tekur líka tíma og fyrirhöfn.Blettirnir sem notaðir eru etídíumbrómíð eru skaðlegir mannslíkamanum og þessar flóknu tilraunaaðferðir gefa möguleika á mengun og fölskum jákvæðum.Hins vegar þarf FQ-PCR aðeins að opna lokið einu sinni við hleðslu sýnis, og síðara ferlið er algjörlega lokað rör, sem krefst ekki PCR eftirvinnslu, og forðast marga galla í hefðbundnum PCR aðgerðum.Tilraunin notar almennt ABI7100 PCR hitauppstreymi sem þróað var af PE fyrirtæki.
Tækið hefur eftirfarandi eiginleika: ① Víðtæk notkun: Það er hægt að nota til að mæla DNA og RNA PCR vöru, rannsóknir á genatjáningu, sjúkdómsgreiningu og hagræðingu á PCR skilyrðum.② Einstök meginregla: Með því að nota flúrljómandi merkta rannsaka mun magn flúrljómunar safnast upp með PCR hringrásinni eftir leysirörvun, til að ná tilgangi magngreiningar.③ Mikil vinnuskilvirkni: Innbyggður 9600 PCR hitauppstreymi, tölvustýrður 1 til 2 klukkustundir til að ljúka mögnun og magngreiningu 96 sýna sjálfkrafa og samstillt.④ Engin þörf á hlaup rafdrætti: Engin þörf á að þynna og rafskaða sýnið, notaðu bara sérstakan rannsaka til að greina beint í hvarfrörinu.⑤Engin mengun í leiðslunni: Einstakt fulllokað viðbragðsrör og ljósleiðnikerfi eru samþykkt, svo það er engin þörf á að hafa áhyggjur af mengun.⑥ Niðurstöðurnar eru endurritanlegar: megindlega hreyfisviðið er allt að fimm stærðargráður.Þess vegna, síðan þessi tækni var þróuð með góðum árangri, hefur hún verið metin af mörgum vísindamönnum og hefur verið beitt á mörgum sviðum.
2 Meginreglur og aðferðir
Vinnureglan FQ-PCR er að nota 5′→3′ exonuclease virkni Taq ensíms til að bæta flúrljómandi merktum rannsaka við PCR hvarfkerfið.Nefndin getur blandað sér sérstaklega við DNA sniðmátið sem er í grunnröðinni.5′endinn á rannsakandanum er merktur með flúrljómunarútstreymisgeninu FAM (6-karboxýflúrljómun, hámarki flúrljómunarlosunar við 518nm), og 3′endinn er merktur með flúrljómunardeyfingarhópnum TAMRA (6-karboxýtetrametýlflúormetýlródamíni, 5-karboxýtetrametýlflúorrhodamíni, 3′n flúormetýlrótamíni, 5′n flúorródamíni). töfrun á rannsakanum er fosfórýleruð til að koma í veg fyrir að rannsakann sé framlengdur meðan á PCR mögnun stendur.Þegar rannsakandinn er ósnortinn bælir slökkvihópurinn flúrljómun losunar hópsins sem gefur út.Þegar losunarhópurinn er aðskilinn frá slökkvihópnum er hömlunin aflétt og sjónþéttleiki við 518nm eykst og er greindur af flúrljómunarskynjunarkerfinu. Í endureðlunarfasanum blandast rannsakandinn við sniðmáts-DNA, og Taq ensímið í framlengingarfasanum færist meðfram DNA primer-sniðmátinu með framlengingu á frumefninu.Þegar könnunin er skorin af losnar slökkviáhrifin og flúrljómunarmerkið losnar.Í hvert skipti sem sniðmátið er afritað er rannsakandi skorið af, ásamt því að gefa út flúrljómandi merki.Þar sem það er eitt-á-mann samband á milli fjölda losaðra flúorófóra og fjölda PCR-afurða, er hægt að nota þessa tækni til að mæla sniðmátið nákvæmlega.Tilraunatækið notar almennt ABI7100 PCR hitauppstreymi sem þróað er af PE fyrirtæki, og einnig er hægt að nota aðra hitauppstreymi.Ef ABI7700 viðbragðsgerð viðbragðskerfi er notað fyrir tilraunina, eftir að hvarfinu er lokið, er hægt að gefa magn niðurstöður beint með tölvugreiningu.Ef þú notar aðra hitahringrás þarftu að nota flúrljómunarskynjara til að mæla flúrljómunarmerkið í hvarfrörinu á sama tíma til að reikna út RQ+, RQ-, △RQ.RQ+ táknar hlutfall ljómastyrks flúrljómunarútblásturshóps sýnaglassins og ljómunarstyrks slökkvihópsins, RQ- táknar hlutfallið af þessu tvennu í auða túpunni, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) táknar magn gagnabreytinga meðan á flúrljómun er hægt að fá niðurstöður eftir PCR.Vegna tilkomu flúrljómunarnema er sérhæfni tilraunarinnar verulega bætt.Hönnun rannsakans ætti almennt að uppfylla eftirfarandi skilyrði: ① Lengd rannsakans ætti að vera um 20-40 basar til að tryggja sérhæfni bindingar.② Innihald GC basa er á milli 40% og 60% til að koma í veg fyrir tvítekningu á stakri núkleótíðröð.③ Forðastu blendingu eða skarast við primera.④ Stöðugleiki bindingarinnar milli rannsakans og sniðmátsins er meiri en stöðugleiki bindingarinnar milli grunnsins og sniðmátsins, þannig að Tm gildi rannsakans ætti að vera að minnsta kosti 5°C hærra en Tm gildi grunnsins.Að auki hefur styrkur rannsakans, samlíkingin milli rannsakans og sniðmátröðarinnar og fjarlægðin milli rannsakans og grunnsins öll áhrif á niðurstöður tilrauna.
Skyldar vörur:
Kína Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman Framleiðandi og birgir |Foregene (foreivd.com)
Birtingartími: 15. október 2021
