Grunnhönnunargrunnur (99% vandamál er hægt að leysa)
1. Grunnlengd: Kennslubókin krefst 15-30bp, venjulega um 20bp.Raunverulegt ástand er betra að vera 18-24bp til að tryggja sérhæfni, en því lengur því betri, of langur grunnur mun einnig draga úr sértækni og draga úr ávöxtun.
2. Grunnmögnunarsvið: 200-500bp er viðeigandi og hægt er að stækka brotið í 10kb við sérstakar aðstæður.
3. Grunngrunnur: Innihald G+C ætti að vera 40-60%, of lítil G+C mögnunaráhrif eru ekki góð, of mikið G+C er auðvelt að birtast ósértækar hljómsveitir.ATGC er best dreift af handahófi og forðast þyrpingar með meira en 5 púrín- eða pýrimídínkirni.Multi-gc fyrir 5′ enda og milliraðir til að auka stöðugleika, forðast ríkan GC í 3′ endanum, ekkert GC fyrir síðustu 3 basana eða ekkert GC fyrir 3 af síðustu 5 bösunum.
4. Forðastu aukabyggingu í primerum, og forðastu viðbót á milli tveggja primera, sérstaklega viðbót í 3' endanum, annars myndast primer dimer og ósértæk mögnuð bönd verða til.
5. Basana í 3' enda primers, sérstaklega síðasta og næstsíðasta basa, ætti að vera stranglega parað til að forðast PCR bilun vegna óparaðra endanlegra basa.
6. Primers hafa eða má bæta við með viðeigandi klofningsstöðum og mögnuðu markröðin ætti helst að hafa viðeigandi klofningsstaði, sem er mjög gagnlegt fyrir klofningsgreiningu eða sameindaklónun.
7. Sérhæfni frumra: frumur ættu ekki að hafa augljósa samsvörun við aðrar raðir í kjarnsýruröð gagnagrunninum.
8. Lærðu að nota hugbúnað: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Þessi nethönnun virkar best).
Ofangreint innihald getur leyst að minnsta kosti 99% af grunnhönnunarvandamálum.
Stjórnaðu smáatriðum grunnhönnunar
1. Grunnur lengd
Almenn grunnlengd er 18~30 basar.Almennt séð er mikilvægasti þátturinn sem ákvarðar hitunarhitastig grunnsins lengd grunnsins.Hitastig grunnsins er almennt valið (Tm gildi -5 ℃) og sumir nota beint Tm gildi.Hægt er að nota eftirfarandi formúlur til að reikna gróflega út hitunarhitastig grunna.
Þegar lengd grunnsins er minni en 20bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Þegar lengd grunnsins er meiri en 20bp: 62,3℃+0,41℃(%GC)-500/lengd-5℃
Að auki er einnig hægt að nota marga hugbúnað til að reikna út glóðhitastigið, útreikningsreglan verður öðruvísi, þannig að stundum getur reiknað gildi haft lítið bil.Til að hámarka PCR viðbrögð eru stystu primerarnir sem tryggja glæðuhitastig sem er ekki minna en 54 ℃ notaðir fyrir bestu skilvirkni og sérhæfni.
Þegar á heildina er litið eykst sérhæfni fruma um fjóra stuðli fyrir hvert kirni til viðbótar, þannig að lágmarkslengd grunns fyrir flestar notkun er 18 núkleótíð.Efri mörk grunnlengdar eru ekki mjög mikilvæg, aðallega tengd viðbragðsvirkni.Vegna óreiðu, því lengri sem primerinn er, því lægri er hraðinn sem hann bindast við mark-DNA til að mynda stöðugt tvíþátta sniðmát fyrir DNA-pólýmerasi að bindast.
Þegar hugbúnaður er notaður til að hanna primera er hægt að ákvarða lengd primers með TM gildi aftur á móti, sérstaklega fyrir primera með flúrljómunar magn PCR, ætti að stjórna TM=60℃ eða svo.
2.GC innihald
Almennt er innihald G+C í grunnröðum 40% ~ 60%, og GC innihald og Tm gildi pars af grunni ætti að vera samræmt.Ef primerinn hefur alvarlega GC eða AT tilhneigingu, má bæta viðeigandi magni af A, T eða G og C hala við 5' enda primersins.
3. Hreinsunarhiti
Hreinsunarhitastigið ætti að vera 5 ℃ lægra en keðjuhitastigið.Ef fjöldi grunnbasa er lítill, er hægt að hækka hitunarhitastigið á viðeigandi hátt, sem getur aukið sértækni PCR.Ef fjöldi basa er mikill er hægt að lækka glæðuhitastigið á viðeigandi hátt.Hitastigsmunurinn á milli grunnapars 4℃ ~ 6℃ mun ekki hafa áhrif á PCR-afraksturinn, en helst er hitastigið á grunni pars það sama, sem getur verið breytilegt á milli 55 ℃ ~ 75 ℃.
4. Forðastu aukabyggingarsvæði mögnunarsniðmátsins
Það er best að forðast aukabyggingarsvæði sniðmátsins þegar magnaða brotið er valið.Hægt er að spá fyrir um og áætla stöðuga aukabyggingu markbútsins með viðeigandi tölvuhugbúnaði, sem er gagnlegt við val á sniðmáti.Tilraunaniðurstöður sýna að stækkunin er oft misheppnuð þegar frjáls orka (△G) svæðisins sem á að stækka er minni en 58,6 lkJ/mól.
5. Misræmi við mark DNA
Þegar magnaða mark-DNA röðin er stór getur primer tengst mörgum hlutum mark-DNA, sem leiðir til þess að margar bönd birtast í niðurstöðunni.Að þessu sinni er nauðsynlegt að nota BLAST hugbúnaðarprófun, vefsíðu:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Veldu Align two runs (bl2seq).
Það er skiptanlegt að líma primer raðir á svæði 1 og mark-DNA raðir á svæði 2 og BLAST reiknar út complementary, antisense og aðra möguleika, þannig að notendur þurfa ekki að taka eftir því hvort báðar keðjurnar séu skynkeðjur.Þú getur líka slegið inn GI-númerið ef þú veist GI-númerið á röðinni í gagnagrunninum, þannig að þú þarft ekki að líma stóran hluta af röðinni.Að lokum skaltu smella á Align við 3 til að sjá hvort grunnurinn hafi marga samhljóða staði í mark-DNA.
6. Grunnstöð
3 'endinn á grunninum er þar sem framlengingin byrjar, svo það er mikilvægt að koma í veg fyrir að ósamræmi byrji þar.3 'endinn ætti ekki að vera meira en 3 samfelldir G eða C, vegna þess að þetta mun valda því að primerinn verður ranglega ræstur á G+C auðgunarraðsvæðinu.3 'endinn getur ekki myndað neina aukabyggingu, nema í sérstökum PCR (AS-PCR) viðbrögðum, er ekki hægt að misjafna 3' enda primersins.Til dæmis, ef kóðunarsvæðið er magnað, ætti ekki að stöðva 3'-enda primersins í þriðju stöðu kódonsins, vegna þess að þriðju staða kódonsins er hætt við að hrörna, sem mun hafa áhrif á sérhæfni og skilvirkni mögnunar.Þegar annexation primers eru notaðir, vísað til codon notkunartöflunnar, gaum að líffræðilegu vali, ekki nota annexation primera í 3′ endanum og nota hærri styrk primers (1uM-3uM).
7. Aukabygging grunna
Primerarnir sjálfir ættu ekki að hafa viðbótarraðir, annars munu primerarnir sjálfir brjóta saman í hárnálabyggingu og þessi aukabygging mun hafa áhrif á bindingu primers og sniðmáta vegna sterískrar hindrunar.Ef gervidómur er notaður ættu samfelldir viðbótarbasar primers sjálfra ekki að vera stærri en 3bp.Það ætti ekki að vera nein fylling á milli primeranna tveggja, sérstaklega ætti að forðast samfellda skörun á 3' endanum til að koma í veg fyrir myndun primer dimera.Almennt séð ætti ekki að vera meira en 4 samfelldir basar samsvörun eða fylling á milli primerapars.
8. Bættu við merkjum eða stöðum
5 'endinn hefur lítil áhrif á mögnunarsérhæfni og því er hægt að breyta honum án þess að hafa áhrif á mögnunarsérhæfni.Breytingin á grunni 5'enda fól í sér: að bæta við ensímtakmörkunarstað;Merkt bíótín, flúrljómun, digoxín, Eu3+, osfrv. Kynna próteinbindandi DNA raðir;Innleiðing stökkbreytingastaða, stökkbreytingaraðir settar inn og vantar og kynning á promotorröðum o.s.frv. Auka basarnir munu meira og minna hafa áhrif á skilvirkni mögnunar og auka líkur á primer dimer myndun, en þó verður að gefa eitthvað eftir fyrir næsta skref.Hægt er að bæta við viðbótarröðum sem ekki eru til á markröðinni, svo sem takmörkunarstöðum og frumkvöðlaröðum, við 5′ enda primersins án þess að hafa áhrif á sérhæfni.Þessar raðir eru ekki teknar með í útreikningi á grunngildum Tm, en ætti að prófa með tilliti til fyllingar og innri aukabyggingar.
9. Undirklónir
Oftast er PCR aðeins bráðabirgðaklónun og þá þurfum við að undirklóna markbútinn í ýmsa vektora, þannig að við þurfum að hanna viðbótarbasa fyrir næstu aðgerð í PCR skrefinu.
Sumar raðir sem eru hannaðar fyrir undirklónun eru teknar saman hér að neðan.
Takmörkunarendonucleasa takmörkunarstaður var bætt við
Að bæta við ensímtakmörkunarstöðum er algengasta aðferðin til að undirklóna PCR vörur.Almennt er klofningsstaðurinn sex basar, auk 5 'enda klofningsstaðarins þarf að bæta við 2 ~ 3 verndandi basum.Hins vegar er fjöldi verndarbasa sem mismunandi ensím þarfnast mismunandi.Til dæmis þarf SalⅠ engan hlífðarbasa, EcoRⅤ þarf 1 hlífðarbasa, NotⅠ þarf 2 hlífðarbasa og Hind Ⅲ þarf 3 hlífðarbasa.
LIC bætir skottinu við
Fullt nafn LIC er Ligation-Independent klónun, klónunaraðferð sem Navogen fann upp sérstaklega fyrir sinn hluta af pET ferjunni.PET burðarefnið sem er útbúið með LIC aðferð hefur ósamstæða 12-15 basa einstrengja klístraða enda, sem bæta við samsvarandi klístraða enda á markinnskotsbrotinu.Í mögnunarskyni ætti 5′ grunnröðin á innsettu brotinu að vera viðbót við LIC ferjuna.3′→5′ utanaðkomandi virkni T4 DNA pólýmerasa getur myndað einstrengja klístraða enda á innsettu brotinu eftir stuttan tíma.Vegna þess að afurðin er aðeins hægt að mynda úr gagnkvæmri glæðingu á tilbúnu innskotsbrotinu og ferjunni, er þessi aðferð mjög hröð og skilvirk og hún er stýrð klónun.
Stýrður TA klón bætir við hala
TA klónun var ófær um að miða brotið inn í ferju, svo síðar kynnti Invitrogen ferju sem gæti miðað við einræktun, sem innihélt fjóra áberandi basa GTGGS í öðrum endanum.Þess vegna, við hönnun PCR grunna, ætti að bæta við viðbótarröðum í samræmi við það, svo að hægt sé að „stilla“ brot.
Ef þú hefur stuttan tíma geturðu prófað beina myndun, sameinað genið við vektorinn, sem er það sem við köllum ET genamyndun hjá vöðvafræðingum.
D. In-Fusion klónunaraðferð
Enginn lígasa krafist, engin lang viðbrögð krafist.Svo framarlega sem röð á báðum endum línugerða vektorins er innleidd Í hönnun primers, þá er PCR afurðinni og línulega ferjunni bætt við innrennslisensímlausnina sem inniheldur BSA og sett við stofuhita í hálftíma, er hægt að framkvæma umbreytinguna.Þessi aðferð er sérstaklega hentug fyrir umbreytingu á miklu magni.
10. Sameina grunnur
Stundum eru aðeins takmarkaðar upplýsingar um röð þekktar um grunnhönnun.Til dæmis, ef aðeins amínósýruröðin er þekkt, er hægt að hanna samruna grunninn.Samruni grunnur er blanda af mismunandi röðum sem tákna alla mismunandi basamöguleika sem kóða eina amínósýru.Til að auka sérhæfni geturðu vísað í töfluna um codonnotkun til að draga úr viðbyggingu í samræmi við grunnnotkunarval mismunandi lífvera.Hýpoxantín er hægt að para saman við alla basana til að lækka hitastig grunnsins.Ekki nota viðhengdu basana í 3′ enda grunnsins vegna þess að tenging síðustu 3 basanna á 3′ endanum er nægjanleg til að hefja PCR á röngum stað.Hærri grunnstyrkur (1μM til 3μM) er notaður vegna þess að grunnur í mörgum viðaukablöndur eru ekki sérstakur fyrir marksniðmátið.
PCR hráefnistjórna
1. Grunnur magn
Styrkur hvers grunns er 0,1 ~ 1umól eða 10 ~ 100pmol.Það er betra að ná tilætluðum árangri með minnsta magni af grunni.Hár styrkur primers veldur misjafnri og ósértækri mögnun og eykur líkurnar á myndun dimera á milli primera.
2. Grunnstyrkur
Styrkur primers hefur áhrif á sérhæfni.Besti grunnstyrkurinn er yfirleitt á milli 0,1 og 0,5μM.Hærri primer styrkur leiðir til mögnunar ósértækra vara.
3. Hreinsunarhitastig grunns
Önnur mikilvæg breytu fyrir grunna er bræðsluhitastig (Tm).Þetta er hitastigið þegar 50% af frumurunum og viðbótarröðunum eru sýndar sem tvíþátta DNA sameindir.Tm er nauðsynlegt til að stilla PCR glæðingarhitastig.Ákjósanlegast er að hitastigið við hitastigið sé nógu lágt til að tryggja árangursríka tengingu frumanna við markröðina, en nógu hátt til að draga úr ósértækri bindingu.Sanngjarnt glæðuhitastig frá 55 ℃ til 70 ℃.Hreinsunarhitastig er almennt stillt 5 ℃ lægra en Tm af grunni.
Það eru nokkrar formúlur til að stilla Tm, sem eru mjög mismunandi eftir formúlunni sem notuð er og röð frumra.Vegna þess að flestar formúlur gefa áætlað Tm-gildi, eru öll glæðingarhitastig aðeins upphafspunktur.Hægt er að bæta sérhæfni með því að greina nokkur viðbrögð sem hækka hitastigið smám saman.Byrjaðu undir áætlaðri Tm-5 ℃ og aukið hitastigið smám saman um 2 ℃.Hærra hitastig dregur úr myndun grunndímera og ósértækra vara.Til að ná sem bestum árangri ættu primerarnir tveir að hafa áætluð Tm gildi.Ef Tm munurinn á grunnpörum er meira en 5 ℃ munu grunnarnir sýna marktæka rangbyrjun með því að nota lægra glæðingarhitastig í lotunni.Ef primerarnir tveir Tm eru ólíkir skaltu stilla glæðingarhitastigið á 5 ℃ lægra en lægsta Tm.Að öðrum kosti, til að auka sérhæfni, er hægt að framkvæma fimm lotur fyrst við glæðingarhitastig sem er hannað fyrir hærra Tm, fylgt eftir af lotunum sem eftir eru við glæðingarhitastig sem hannað er fyrir lægra Tm.Þetta gerir kleift að fá hluta afrit af áfangasniðmátinu við þröng skilyrði.
4. Grunnur hreinleiki og stöðugleiki
Staðlaður hreinleiki sérsniðinna grunna er fullnægjandi fyrir flest PCR forrit.Fjarlæging bensóýl- og ísóbútýlýlhópa með afsöltun er í lágmarki og hefur því ekki áhrif á PCR.Sum forrit krefjast hreinsunar til að fjarlægja allar raðir sem ekki eru í fullri lengd í nýmyndunarferlinu.Þessar styttu raðir eiga sér stað vegna þess að skilvirkni efnafræði við myndun DNA er ekki 100%.Þetta er hringlaga ferli sem notar endurtekin efnahvörf þar sem hverjum basa er bætt við til að búa til DNA frá 3′ til 5′.Þú getur mistekist í hvorri lotunni sem er.Lengri primers, sérstaklega þeir sem eru stærri en 50 basar, hafa stóran hluta af styttri röð og gætu þurft hreinsun.
Afrakstur primers hefur áhrif á skilvirkni tilbúinnar efnafræði og hreinsunaraðferð.Líflyfjafyrirtæki, eins og Cytology og Shengong, nota öll lágmarks OD-einingu til að tryggja heildarframleiðslu fákirnis.Sérsniðnir grunnar eru sendir í þurrduftformi.Best er að endurleysa primerana í TE þannig að endanlegur styrkur sé 100μM.TE er betra en afjónað vatn vegna þess að pH vatns er oft súrt og veldur vatnsrofi fákirnis.
Stöðugleiki primers fer eftir geymsluaðstæðum.Þurrt duft og uppleysta grunnur skal geyma við -20 ℃.Primers sem eru leystir upp í TE í styrk sem er meiri en 10μM er hægt að geyma stöðugt við -20 ℃ í 6 mánuði, en aðeins hægt að geyma við stofuhita (15 ℃ til 30 ℃) í minna en 1 viku.Þurrduft grunnur má geyma við -20 C í að minnsta kosti 1 ár og við stofuhita (15 C til 30 C) í allt að 2 mánuði.
5. Ensím og styrkur þeirra
Sem stendur er Taq DNA pólýmerasinn sem notaður er í grundvallaratriðum genatækniensímið sem er búið til af kólígerlum.Magn ensíms sem þarf til að hvetja dæmigerð PCR viðbrögð er um 2,5U (vísar til heildarhvarfsrúmmáls 100 ul).Ef styrkurinn er of hár getur það leitt til ósértækrar mögnunar;ef styrkurinn er of lágur minnkar magn tilbúinnar vöru.
6. Gæði og styrkur dNTP
Gæði dNTP eru nátengd styrkleika og skilvirkni PCR mögnunar.DNTP duftið er kornótt og breytileiki þess missir líffræðilega virkni ef það er óviðeigandi geymt.dNTP lausnin er súr og ætti að nota hana í háum styrk, með 1M NaOH eða 1M Tris.HCL jafnalausn til að stilla PH hennar í 7,0 ~ 7,5, lítið magn af undirumbúðum, fryst geymsla við -20 ℃.Margþætt frost-þíðing mun rýra dNTP.Í PCR viðbrögðum ætti dNTP að vera 50 ~ 200umól/L.Sérstaklega ætti að borga eftirtekt til styrkur fjögurra DNTPS ætti að vera jafn (jafn mól undirbúningur).Ef styrkur einhvers þeirra er frábrugðinn hinna (hærri eða lægri) veldur misræmi.Of lágur styrkur mun draga úr ávöxtun PCR efna.dNTP getur sameinast Mg2+ og dregið úr styrk óbundins Mg2+.
7. Sniðmát (markgen) kjarnsýra
Magn og hreinsunarstig sniðmátkjarnsýru er einn af lykilhlekkjunum fyrir árangur eða bilun PCR.Hefðbundnar DNA hreinsunaraðferðir nota venjulega SDS og próteasa K til að melta og farga sýnum.Helstu hlutverk SDS eru: leysa upp lípíð og prótein á frumuhimnunni, eyðileggja þannig frumuhimnuna með því að leysa upp himnuprótein, og sundra kjarnapróteinum í frumunni, SDS getur einnig sameinast próteinum og botnfall;Próteasi K getur vatnsrofið og melt prótein, sérstaklega histón bundið við DNA, og síðan notað lífrænt leysi fenól og klóróform til að draga út prótein og aðra frumuhluta, og notað etanól eða ísóprópýlalkóhól til að fella út kjarnsýru.Hægt er að nota útdregna kjarnsýruna sem sniðmát fyrir PCR viðbrögð.Fyrir almenn klínísk greiningarsýni er hægt að nota fljótlega og einfalda aðferð til að leysa upp frumur, lýsa sýkla, melta og fjarlægja prótein úr litningum til að losa markgen og nota beint til PCR mögnunar.Útdráttur RNA sniðmáts notar venjulega guanidínísóþíósýanat eða próteasa K aðferð til að koma í veg fyrir að RNase brotni niður RNA.
8.Mg2+ styrkur
Mg2+ hefur marktæk áhrif á sértækni og afrakstur PCR mögnunar.Almennt PCR viðbrögð, þegar styrkur ýmissa dNTP er 200umól/L, er viðeigandi styrkur Mg2+ 1,5 ~ 2,0mmól/L.Mg2+ styrkur er of hár, hvarfsérhæfni minnkar, ósértæk mögnun á sér stað, of lágur styrkur mun draga úr virkni Taq DNA pólýmerasa, sem leiðir til minnkunar á hvarfafurðum.
Magnesíumjónir hafa áhrif á nokkra þætti PCR, svo sem virkni DNA pólýmerasa, sem hefur áhrif á uppskeru;Annað dæmi er primer annealing, sem hefur áhrif á sérhæfni.dNTP og sniðmát bindast magnesíumjónum, sem dregur úr magni frjálsrar magnesíumjónar sem þarf til ensímvirkni.Ákjósanlegur magnesíumjónastyrkur er breytilegur fyrir mismunandi grunnpör og sniðmát, en dæmigerður PCR upphafsstyrkur með 200μM dNTP er 1,5mM (athugið: Fyrir rauntíma magn PCR, notaðu 3 til 5mM magnesíumjónalausn með flúrljómandi rannsaka).Hærri styrkur frjálsra magnesíumjóna eykur afrakstur, en eykur einnig ósértæka mögnun og dregur úr tryggð.Til að ákvarða ákjósanlegan styrk voru magnesíumjónatítrar framkvæmdar í 0,5mM þrepum frá 1mM til 3mM.Til að draga úr ósjálfstæði á fínstillingu magnesíumjóna er hægt að nota Platinum Taq DNA pólýmerasa.Platinum Taq DNA pólýmerasi er fær um að viðhalda virkni yfir breiðari magn magnesíumjónastyrks en Taq DNA pólýmerasi og krefst því minni hagræðingar.
9. Pcr-hvetjandi aukefni
Hagræðing á hitastigi hita, grunnhönnun og magnesíumjónastyrk nægir fyrir mjög sértæka mögnun á flestum sniðmátum;þó, sum sniðmát, þar á meðal þau með hátt GC innihald, krefjast viðbótarráðstafana.Aukefni sem hafa áhrif á bræðsluhitastig DNA veita aðra leið til að bæta sértækni vöru og afrakstur.Nauðsynlegt er að sniðmátið sé algjörlega eðst til að ná sem bestum árangri.
Auk þess kemur aukabyggingin í veg fyrir bindingu grunns og framlengingu ensíma.
PCR aukefni, þar á meðal formamíð, DMSO, glýserín, betaín og PCRx Enhancer lausn, auka mögnun.Mögulegur búnaður þeirra er að lækka bræðsluhitastigið, þannig að aðstoða við að sameina primers og aðstoða við að framlengja DNA pólýmerasa í gegnum aukabyggingarsvæðið.PCRx lausn hefur aðra kosti.Lágmarks fínstillingu magnesíumjóna er nauðsynleg þegar þau eru notuð með Platinum Taq DNA pólýmerasa og Platinum Pfx DNA pólýmerasa.Þannig er Platinum tæknin sameinuð aukefninu til að auka sérhæfni en draga úr ósjálfstæði þriðju aðferðarinnar, magnesíumjóna fínstillingu.Til að ná sem bestum árangri ætti að fínstilla styrk aukefna, sérstaklega DMSO, formamíð og glýseról, sem hindra Taq DNA pólýmerasa.
10. Heit byrjun
Hot start PCR er ein mikilvægasta aðferðin til að bæta PCR sérhæfni auk góðrar grunnhönnunar.Þrátt fyrir að ákjósanlegur lengingarhiti Taq DNA pólýmerasa sé 72 ℃, helst fjölliðan virkur við stofuhita.Þannig eru ósértækar vörur framleiddar þegar geymsluhitastigið er lægra en glæðingarhitastigið meðan á undirbúningi PCR hvarfsins stendur og í upphafi varmalotunnar.Þegar þær hafa myndast eru þessar ósértæku vörur í raun magnaðar.Hot-start PCR er sérstaklega árangursríkt þegar staðirnir sem notaðir eru til grunnhönnunar eru takmarkaðir af staðsetningu erfðaþátta, eins og staðstýrðar stökkbreytingar, tjáningarklónun eða smíði og meðhöndlun erfðaþátta sem notaðir eru við DNA verkfræði.
Algeng aðferð til að takmarka virkni Taq DNA pólýmerasa er að búa til PCR hvarflausn á ís og setja hana í forhitað PCR tæki.Þessi aðferð er einföld og ódýr, en hún lýkur ekki virkni ensímsins og útilokar því ekki mögnun ósérhæfðra vara.
Thermal priming seinkar myndun DNA með því að hindra nauðsynlegan þátt þar til PCR búnaðurinn nær afeðlunarhitastigi.Flestar handvirkar hitaupphafsaðferðir, þar á meðal seinkun á Taq DNA pólýmerasa, eru fyrirferðarmikil, sérstaklega fyrir notkun með mikilli afköst.Aðrar hitauppstreymisaðferðir nota vaxhlíf til að umlykja nauðsynlegan þátt, þar á meðal magnesíumjónir eða ensím, eða til að einangra hvarfgjarna efnisþætti líkamlega, svo sem sniðmát og stuðpúða.Í hitaferlinu losna hinir ýmsu efnisþættir og blandast saman þegar vaxið bráðnar.Eins og handvirka heitræsingaraðferðin er vaxhlífaraðferðin fyrirferðarmikil og viðkvæm fyrir mengun og hentar ekki fyrir notkun með miklum afköstum.
Platinum DNA pólýmerasi er þægilegur og skilvirkur fyrir sjálfvirka heitræsingar PCR.Platinum Taq DNA pólýmerasi samanstendur af raðbrigðum Taq DNA pólýmerasa ásamt einstofna mótefni gegn Taq DNA pólýmerasa.Mótefnin eru mynduð með PCR til að hindra ensímvirkni meðan á langvarandi hitastigi stendur.Taq DNA pólýmerasi var sleppt út í hvarfið á meðan á 94 ℃ einangrun afeitunarþrepsins stóð, sem endurheimtir fulla pólýmerasavirkni.Öfugt við efnafræðilega breyttan Taq DNA pólýmerasa fyrir hitaupptöku, þarf platínuensím ekki langvarandi einangrun við 94 ℃ (10 til 15 mínútur) til að virkja pólýmerasann.Með PlatinumTaq DNA pólýmerasa var 90% af Taq DNA pólýmerasa virkni endurheimt eftir 2 mínútur við 94 ℃.
11. Nest-PCR
Eftirfarandi umferðir af mögnun með því að nota hreiðra primera geta bætt sértækni og næmi.Fyrsta umferðin er venjuleg mögnun í 15 til 20 lotum.Lítið brot af upphafsmögnunarafurðinni var þynnt 100 til 1000 sinnum og bætt við aðra umferð mögnunar í 15 til 20 lotur.Að öðrum kosti er hægt að stærða upphafsmögnuðu vöruna með hlauphreinsun.Hreiður grunnur er notaður í annarri umferð mögnunar, sem getur bundist markröðinni inni í fyrsta grunninum.Notkun hreiðraðs PCR dregur úr möguleikum á mögnun margra markstaða vegna þess að það eru fáar markraðir sem eru viðbót við bæði sett primers.Sami heildarfjöldi lota (30 til 40) með sömu frumurum magnaði upp ósértæku staðina.Nested PCR eykur næmni takmarkaðra markraða (td sjaldgæfar mrnas) og bætir sértækni erfiðra PCRS (td 5' RACE).
12. Lækkandi PCR
Lækkandi PCR bætir sérhæfni með því að nota þétt glæðingarskilyrði fyrir fyrstu loturnar af PCR.Hringrásin byrjar við útglöðuhitastig sem er um það bil 5 ℃ hærra en áætlað Tm, síðan er hver lota minnkað um 1 ℃ til 2 ℃ þar til hitastigið er undir Tm 5 ℃.Aðeins áfangasniðmátið með hæstu samlíkingu verður magnað upp.Þessar vörur halda áfram að stækka í síðari lotum og troða upp magnaðar ósértæku vörurnar.Lækkandi PCR er gagnlegt fyrir aðferðir þar sem ekki er vitað hversu mikil samlíking er á milli grunns og marksniðmáts, eins og AFLP DNA fingrafar.
Tengd PCR Kit
2× PCR hetjanTMBlandakerfið hefur hærra þol fyrir PCR hemlum en venjulegt PCR Mix kerfið og getur auðveldlega tekist á við PCR mögnun á ýmsum flóknum sniðmátum.Einstakt hvarfkerfi og hávirkni Taq Hero gera PCR viðbrögðin með meiri mögnunarvirkni, sérhæfni og næmi.
Meiri mögnunarvirkni
Það hefur 5'→3' DNA pólýmerasa virkni og 5'→3' exonucleasa virkni, án 3'→5' exonucleasa virkni.
Rauntíma PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Sérstök-bjartsýni biðminni og heitræst Taq ensím geta komið í veg fyrir ósértæka mögnun og myndun primer dimera
Mikið næmi—getur greint lítil afrit af sniðmáti
Settið notar einstakt Foregene öfugt umritunarefni og Foregene HotStar Taq DNA pólýmerasa ásamt einstöku hvarfkerfi til að bæta mögnunarvirkni og sérhæfni hvarfsins á áhrifaríkan hátt.
Pósttími: maí-09-2023
