• PCR er aðferð notuð til að magna upp DNA úr litlu magni af DNA sniðmáti.RT-PCR notar öfuga umritun til að framleiða DNA sniðmát úr RNA uppsprettu sem síðan er hægt að magna upp.
• PCR og RT-PCR eru venjulega endapunktsviðbrögð, á meðan qPCR og RT-qPCR nota hreyfihraða framleiðsluhraðans meðan á PCR viðbrögðum stendur til að mæla magn sniðmáts sem er til staðar.
• Nýrri aðferðir, eins og stafræn PCR, veita algera magngreiningu á upphaflegu DNA sniðmátinu, en aðferðir eins og jafnhita PCR draga úr þörfinni fyrir dýran búnað til að veita áreiðanlegar niðurstöður.

Pólýmerasa keðjuverkun (PCR) er tiltölulega einföld og mikið notuð sameindalíffræðitækni til að magna upp og greina DNA og RNA röð.Í samanburði við hefðbundnar aðferðir við klónun og mögnun DNA, sem geta oft tekið daga, þarf PCR aðeins nokkrar klukkustundir.PCR er mjög viðkvæmt og krefst lágmarks sniðmáts fyrir greiningu og mögnun á tilteknum röðum.Grunn PCR aðferðir hafa þróast enn frekar frá einfaldri DNA og RNA greiningu.Hér að neðan höfum við veitt yfirlit yfir mismunandi PCR aðferðir og hvarfefnin sem við útvegum hjá Enzo Life Sciences fyrir rannsóknarþarfir þínar.Við stefnum að því að hjálpa vísindamönnum að fá fljótt aðgang að PCR hvarfefnum til að nota í næsta rannsóknarverkefni þeirra!

PCR

Fyrir staðlaða PCR, allt sem þú þarft er DNA pólýmerasi, magnesíum, núkleótíð, primers, DNA sniðmátið sem á að magna upp og hitahringrás.PCR vélbúnaðurinn er eins einfaldur og tilgangur þess: 1) tvíþátta DNA (dsDNA) er hitavengd, 2) primers samræmast stökum DNA þráðunum og 3) primerarnir eru framlengdir með DNA pólýmerasa, sem leiðir til tveggja eintaka af upprunalega DNA strengurinn.Hreinsunar-, glæðingar- og lengingarferlið yfir röð hitastigs og tíma er þekkt sem ein hringmögnun (mynd 1).

Hvert skref í lotunni ætti að vera fínstillt fyrir sniðmátið og grunnsettið sem notað er.Þessi hringrás er endurtekin um það bil 20-40 sinnum og síðan er hægt að greina magnaða afurðina, venjulega með agarósageli (mynd 2).

Þar sem PCR er mjög næm aðferð og mjög lítið magn þarf fyrir stakar efnahvörf, er mælt með undirbúningi aðalblöndu fyrir nokkur efnahvörf.Aðalblönduna verður að blanda vel saman og síðan skipta henni eftir fjölda efnahvarfa til að tryggja að hvert efnahvarf innihaldi sama magn af ensímum, dNTP og primers.Margir birgjar, eins og Enzo Life Sciences, bjóða einnig upp á PCR blöndur sem innihalda nú þegar allt nema primera og DNA sniðmátið.

Gúanín/sýtósínrík (GC-rík) svæði eru áskorun í hefðbundinni PCR tækni.GC-ríkar raðir eru stöðugri en raðir með lægra GC innihald.Ennfremur hafa GC-ríkar raðir tilhneigingu til að mynda aukabyggingar, eins og hárnálalykkjur.Fyrir vikið er erfitt að aðskilja GC-ríka tvöfalda þræði að fullu á meðan á eðlisbreytingarskeiðinu stendur.Þar af leiðandi getur DNA pólýmerasi ekki myndað nýja strenginn án hindrunar.Hærra denaturationshitastig getur bætt þetta og aðlögun í átt að hærra glæðingarhitastigi og styttri glæðingartíma getur komið í veg fyrir ósértæka bindingu GC-ríkra grunna.Viðbótarhvarfefni geta aukið mögnun GC-ríkra raða.DMSO, glýseról og betaín hjálpa til við að trufla aukabyggingar sem orsakast af GC víxlverkunum og auðvelda þannig aðskilnað tvíþráðanna.

Hot Start PCR

Ósértæk mögnun er vandamál sem getur komið fram við PCR.Flestir DNA pólýmerasar sem eru notaðir við PCR virka best við hitastig í kringum 68°C til 72°C.Ensímið getur þó einnig verið virkt við lægra hitastig, þó í lægra mæli.Við hitastig sem er langt undir hleypihitastigi geta primers bundist ósértækt og leitt til ósértækrar mögnunar, jafnvel þótt hvarfið sé sett upp á ís.Hægt er að koma í veg fyrir þetta með því að nota pólýmerasahemla sem skilja sig frá DNA pólýmerasanum aðeins þegar ákveðnu hitastigi er náð, þess vegna er hugtakið hot start PCR.Hemillinn getur verið mótefni sem bindur pólýmerasann og eðlisbreytir við upphafsdenatureringshitastig (95°C venjulega).

High Fidelity Polymerase

Þó að DNA-pólýmerasar magni nokkuð nákvæmlega upp í upprunalegu sniðmátsröðina, geta mistök átt sér stað í núkleótíðsamsvörun.Ósamræmi í forritum eins og klónun getur leitt til styttra umrita og misþýddra eða óvirkra próteina niðurstreymis.Til að forðast þessa ósamræmi hafa pólýmerasar með „prófarkalestur“ verið auðkenndir og teknir inn í verkflæðið.Fyrsti prófarkalestur pólýmerasinn, Pfu, var auðkenndur árið 1991 í Pyrococcus furiosus.Þetta Pfu ensím hefur 3' til 5' exonuclease virkni.Þegar DNA er magnað, fjarlægir exonucleasi ósamræmd núkleótíð í 3' enda strengsins.Þá er réttu núkleótíðinu skipt út og DNA-myndun heldur áfram.Að bera kennsl á rangar núkleótíðraðir byggir á bindandi sækni fyrir rétta núkleósíð þrífosfat við ensímið, þar sem óhagkvæm binding hægir á nýmyndun og gerir ráð fyrir réttri skipti.Prófarkalestur virkni Pfu pólýmerasa leiðir til færri villur í loka röð samanborið við Taq DNA pólýmerasa.Á undanförnum árum hafa önnur prófarkalestur ensím verið auðkennd og breytingar á upprunalega Pfu ensíminu hafa verið gerðar til að draga enn frekar úr villuhraða við DNA mögnun.

RT-PCR

Reverse Transscription PCR, eða RT-PCR, gerir kleift að nota RNA sem sniðmát.Viðbótarskref gerir greiningu og mögnun RNA kleift.RNA er öfugt umritað í complementary DNA (cDNA), með því að nota öfugt umrit.Gæði og hreinleiki RNA sniðmátsins eru nauðsynleg fyrir árangur RT-PCR.Fyrsta skref RT-PCR er myndun DNA/RNA blendings.Reverse transcriptasi hefur einnig RNase H virkni, sem brýtur niður RNA hluta blendingsins.Einþátta DNA sameindinni er síðan fullkomin með DNA-háðri DNA pólýmerasa virkni bakritans í cDNA.Skilvirkni fyrsta strengs hvarfsins getur haft áhrif á mögnunarferlið.Héðan í frá er hefðbundin PCR aðferð notuð til að magna upp cDNA.Möguleikinn á að snúa RNA yfir í cDNA með RT-PCR hefur marga kosti og hann er fyrst og fremst notaður við genatjáningargreiningu.RNA er einþátta og mjög óstöðugt, sem gerir það krefjandi að vinna með það.Það þjónar almennt sem fyrsta skref í qPCR, sem mælir RNA umrit í lífsýni.

qPCR og RT-qPCR

Magn PCR (qPCR) er notað til að greina, einkenna og magngreina kjarnsýrur fyrir fjölda notkunar.Í RT-qPCR eru RNA-umrit oft magngreind með því að umrita þau í öfugmæli fyrst í cDNA, eins og lýst er hér að ofan, og síðan er qPCR framkvæmt.Eins og í venjulegu PCR er DNA magnað upp með þremur endurteknum skrefum: eðlisbreytingu, glæðingu og lengingu.Hins vegar, í qPCR, gerir flúrljómandi merking kleift að safna gögnum eftir því sem PCR þróast.Þessi tækni hefur marga kosti vegna fjölda aðferða og efnafræði sem til eru.

Í qPCR sem byggir á litarefnum (venjulega grænt), gerir flúrljómandi merking kleift að mæla magn af mögnuðu DNA sameindunum með því að nota dsDNA bindandi litarefni.Í hverri lotu er flúrljómunin mæld.Flúrljómunarmerkið eykst í réttu hlutfalli við magn endurtekins DNA.Þess vegna er DNA magnmælt í „rauntíma“ (mynd 3).Ókostirnir við litarefnisbundið qPCR eru að aðeins er hægt að skoða eitt mark í einu og að litarefnið mun bindast hvaða ds-DNA sem er í sýninu.

Í rannsaka-undirstaða qPCR er hægt að greina mörg markmið samtímis í hverju sýni, en þetta krefst hagræðingar og hönnunar á marksértækum rannsakanda(um) sem notaðir eru til viðbótar við primera.Nokkrar gerðir af rannsakahönnun eru fáanlegar, en algengasta gerðin er vatnsrofsnemi, sem inniheldur flúorófór og slökkvibúnað.Fluorescence resonance energy transfer (FRET) kemur í veg fyrir losun flúorfórsins í gegnum slokknarann ​​á meðan rannsakarinn er ósnortinn.Hins vegar, meðan á PCR hvarfinu stendur, er rannsakað vatnsrofið við framlengingu grunns og mögnun á sértæku röðinni sem hann er bundinn við.Klofnun rannsakans aðskilur flúorfórinn frá slökkvibúnaðinum og veldur mögnunarháðri aukningu á flúrljómun (mynd 4).Þannig er flúrljómunarmerkið frá qPCR-hvarf sem byggir á rannsakanda í réttu hlutfalli við magn rannsakandamarkraðar sem er til staðar í sýninu.Vegna þess að rannsaka-undirstaða qPCR er sértækari en litarefni-undirstaða qPCR, er það oft tæknin sem notuð er í qPCR-undirstaða greiningargreiningar.

Jafnhitamögnun

PCR-tæknin sem nefnd er hér að ofan krefst dýrs varmahringrásarbúnaðar til að hækka og lækka hitastig í hólfinu nákvæmlega fyrir afneitunar-, glæðingar- og framlengingarþrepin.Nokkrar aðferðir hafa verið þróaðar sem þurfa ekki svo nákvæm tæki og hægt er að framkvæma þær í einföldu vatnsbaði eða jafnvel innan frumanna sem vekur áhuga.Þessar aðferðir eru sameiginlega kallaðar jafnhitamögnun og vinna byggt á veldisvísis-, línu- eða kaskaðamögnun.

Þekktasta tegund af jafnhita mögnun er lykkjumiðluð jafnvarma mögnun, eða LAMP.LAMP notar veldisvísis mögnun við 65⁰C til að magna upp sniðmát DNA eða RNA.Þegar LAMP er framkvæmt eru fjórir til sex primers sem eru viðbót við svæði mark-DNA notaðir með DNA fjölliðu til að mynda nýtt DNA.Tveir af þessum primerum eru með samsettar raðir sem þekkja raðir í hinum primerunum og binda þær, sem gerir kleift að mynda „lykkju“ uppbyggingu í nýgerða DNA sem síðan hjálpar primer annealing í síðari mögnunarlotum.LAMP er hægt að sjá fyrir sér með mörgum aðferðum, þar á meðal flúrljómun, agarósa gel rafdrætti eða litamælingu.Auðvelt að sjá og greina nærveru eða fjarveru vöru með litamælingum og skortur á dýrum búnaði sem krafist var gerði LAMP að hentugum valkosti fyrir SARS-CoV-2 próf á svæðum þar sem klínísk prófun á rannsóknarstofu var ekki tiltæk, eða geymslu og flutning sýna. var ekki framkvæmanlegt, eða í rannsóknarstofum sem ekki höfðu áður PCR hitahringrásarbúnað.