Hefðbundnir bakritarar þola ekki háan hita (ákjósanlegur hiti fyrir MMLV virkni er 37-50°C og AMV er 42-60°C).Ekki er hægt að umrita flóknara veiru-RNA á áhrifaríkan hátt í cDNA við lágt hitastig, sem leiðir til skilvirkni greiningarinnar.Hefðbundin RT-qPCR krefst almennt þátttöku tveggja lykilensíma (bakrita og DNA fjölliða), sem gerir það ómögulegt að einfalda virkni hvarfkerfisins og draga úr kostnaði.Hér munum við kynna tvo háhitaþolna bakrita, TtH og RevTaq.Þessi tvö ensím hafa einnig hlutverk DNA-pólýmerasa, svo þau eru kölluð tvívirk ensím.

TtH DNA pólýmerasi

Þú hlýtur að hafa heyrt um TtH, sem er unnin úr hitakæru bakteríunni Thermus thermophilus HB8.Í nærveru tvígildra katjóna eins og Mg2+ hefur það DNA pólýmerasavirkni.Það er mikið notað í PCR viðbrögðum eins og Taq ensím, en það hefur meiri hitaþol en Taq ensím, svo það hefur einnig betri áhrif á PCR með sniðmátum með hátt GC innihald.

· Þetta ensím hefur í grundvallaratriðum enga 3′→5′ exonuclease virkni og 5′→3′ exonuclease virkni, svo það er líka hægt að nota það fyrir dideoxy raðgreiningu.

· Þetta ensím hefur RTase virkni.Í nærveru Mn2+ mun RTase virkni aukast.Með því að nota þennan eiginleika er hægt að nota hann til að framkvæma öfug umritunarviðbrögð og PCR viðbrögð í sömu túpunni, það er eins þrepa RT-PCR.Hins vegar, í nærveru Mn2+, er nákvæmni RT-PCR ekki mikil.RT virkni hefur ekkert með rnaase H virkni að gera.

· Aukin virkni Tth-DNA pólýmerasa (pH9, bestur +55℃～+70℃, hámark +95℃) sigrar vandamálin sem orsakast af RNA-efri uppbyggingu.Hægt er að magna cDNA sem myndast með PCR með sama ensíminu í viðurvist Mg2+ jóna.

· Hæfni Tth-DNA pólýmerasa til að framkvæma öfuga umritun og DNA mögnun við háan hita gerir þetta ensím gagnlegt fyrir megindlega RT-PCR, klónun og genatjáningargreiningu á frumu- og veiru-RNA.
· Tth-DNA pólýmerasi er notaður fyrir RT-PCR til að magna RNA allt að 1kb.

Eiginleikar og kostir

Tth DNA pólýmerasi:

• Tryggja hámarksstærð pólýmerasa keðjuverkunar (PCR), að minnsta kosti 1000 bp í RT-PCR hvarfinu

• Samþykkja breytt deoxýríbónúkleósíð þrífosfat sem hvarfefni

• Ekki tengt RNase H virkni

• Hefur mikinn varmastöðugleika til að sigrast á vandamálum, venjulega tengt mikilli aukabyggingu sem er til staðar í RNA

RevTaq RT-PCR DNA pólýmerasi

Hitaþolinn DNA pólýmerasi með bakritavirkni

RevTaq-RT-PCR-DNA pólýmerasi er hannað, mjög hitaþolið, tvívirkt ensím með bakrita- og DNA-pólýmerasavirkni sem fæst með stýrðri og tilbúinni þróun.

· Helmingunartími RevTaq RT-PCR DNA pólýmerasa við 95°C er lengri en 40 mínútur.

· RevTaq RT-PCR DNA pólýmerasi gerir öfugumritun við háan hita kleift beint frá RNA sniðmátinu og hægt er að endurtaka öfuga umritunarskrefið mörgum sinnum til að búa til fleiri cDNA sniðmát.

· RevTaq RT-PCR DNA pólýmerasi leyfir „núllþreps“ RT-PCR (engin ísóhita öfug umritun), því í hringlaga PCR framlengingarþrepinu eiga sér stað öfug umritun og DNA mögnun samtímis.Þetta stuðlar einnig að öfugum umritunarviðbrögðum við háan hita og lágmarkar þannig vandamálin sem koma upp við að bræða sterka aukabyggingu í RNA við háan hita.

· Vegna heitbyrjunarformúlunnar sem byggir á aptamer, mun RevTaq RT-PCR DNA pólýmerasi skila betri árangri þegar hitastig við glæðingu og framlengingu er hærra en 57°C.

· Þar sem ensímið er hitaþolið er mælt með því að hanna grunna og nema með mjög háu bræðslumarki (>60°C).

· Mælt er með því að hámarka hitastig glæðingar-/lengingarþrepsins í gegnum hitastigsstig meðan á uppsetningarferlinu stendur.

· Því hærra sem hitastigið er, því meiri sértækni PCR.Öfug umritunarlotan er venjulega framkvæmd við hærra hitastig en PCR hringrásin, vegna þess að DNA Primer:RNA Template blending hefur venjulega hærra bræðslumark en DNA Primer:cDNA Template tvíhliða.

· RevTaq RT-PCR DNA pólýmerasi er erfðabreyttur og fínstilltur og magn amplicons er á bilinu 60-300 bp.

RevTaq RT-PCR DNA pólýmerasa greiningarmörk ná 4 eintökum/

Bjartsýni hvarfkerfisins (stofnun hábræðslumarks grunna) er sýnt á myndinni.RevTaq RT-PCR DNA pólýmerasa-drifinn RT-PCR sýnir betra næmni en TaqPath 1-þrepa RT-qPCR master mix, og lægri greiningu Þynningarstig sýnis.

Fleiri kostir:

Flýtiræsingaraðgerð → Hægt er að sleppa fyrstu hitauppstreymisþrepinu.

Hot-start aptamer formúla → Veittu 100% ensímvirkni strax og komdu í veg fyrir ósértæka mögnun við lágt hitastig (<57°C).

Klofnunaraðgerð → RNA-útdráttarþrepinu er sleppt, vegna þess að RevTaq RT-PCR DNA pólýmerasi getur einnig unnið úr hráum hvarfsýnum.Það getur strax eyðilagt frumuhimnur heilkjörnunga, baktería og veira í heitri RT-PCR hringrás.

IVD hráefnisstig → háir gæðastaðlar og afar samkeppnishæf verð