1. Grunnþekking (ef þú vilt sjá tilraunahlutann, vinsamlegast flyttu beint yfir í seinni hlutann)
Sem afleidd viðbrögð hefðbundins PCR fylgist rauntíma PCR aðallega breytingum á magni mögnunarafurðar í hverri lotu PCR mögnunarviðbragða í rauntíma með breytingu á flúrljómunarmerkinu og greinir upphafssniðmátið magnbundið í gegnum sambandið milli ct gildisins og staðalferilsins.
Sértæk gögn um RT-PCR erugrunnlínu, flúrljómunarþröskuldurogCt gildi.
| grunnlína: | Flúrljómunargildi 3.-15. lotunnar er grunnlínan (grunnlínan), sem stafar af einstaka villu í mælingu. |
| Þröskuldur (þröskuldur): | Vísar til flúrljómunargreiningarmörkanna sem eru sett á viðeigandi stað í veldisvaxtarsvæði mögnunarferilsins, yfirleitt 10 sinnum staðalfrávik grunnlínunnar. |
| CT gildi: | Það er fjöldi PCR lota þegar flúrljómunargildið í hverju hvarfglasi nær þröskuldinum. Ct gildið er í öfugu hlutfalli við magn upphafssniðmáts. |
Algengar merkingaraðferðir fyrir RT-PCR:
| aðferð | kostur | annmarka | gildissvið |
| SYBR GrænnⅠ | Víðtækt notagildi, viðkvæmt, ódýrt og þægilegt | Grunnkröfur eru miklar, viðkvæmt fyrir ósértækum böndum | Það er hentugur fyrir magngreiningu á ýmsum markgenum, rannsóknum á genatjáningu og rannsóknum á erfðabreyttum raðbrigðum dýrum og plöntum. |
| TaqMan | Góð sérhæfni og hár endurtekningarhæfni | Verðið er hátt og hentar aðeins fyrir ákveðin markmið. | Sýklauppgötvun, lyfjaþolsgenarannsóknir, mat á virkni lyfja, greining erfðasjúkdóma. |
| sameinda leiðarljós | Mikil sértækni, flúrljómun, lágur bakgrunnur | Verðið er hátt, það hentar aðeins í ákveðnum tilgangi, hönnunin er erfið og verðið er hátt. | Sértæk genagreining, SNP greining |
2. Tilraunaskref
2.1 Um tilraunahópinn- það verða að vera margir brunnar í hópnum og það verða að vera líffræðilegar endurtekningar.
| ① | Autt stjórn | Notað til að greina frumuvaxtarstöðu í tilraunum |
| ② | Neikvætt stjórn siRNA (ósértæk siRNA röð) | Sýndu fram á sérhæfni RNAi virkni.siRNA getur framkallað ósértæk streituviðbrögð við styrkleika 200nM. |
| ③ | Transfection Reagent Control | Útiloka eiturverkanir umbrots hvarfefnisins á frumurnar eða áhrif á tjáningu markgensins |
| ④ | siRNA gegn markgeni | Taktu niður tjáningu markgensins |
| ⑤ (valfrjálst) | jákvætt siRNA | Notað til að leysa tilraunakerfi og rekstrarvandamál |
| ⑥ (valfrjálst) | Flúrljómandi stjórn siRNA | Hægt er að fylgjast með skilvirkni frumuflutnings með smásjá |
2.2 Meginreglur grunnhönnunar
| Magnuð brotastærð | Helst á 100-150 bp |
| Grunnur Lengd | 18-25 bp |
| GC innihald | 30%-70%, helst 45%-55% |
| Tm gildi | 58-60 ℃ |
| Röð | Forðastu T/C samfellda;A/G samfellt |
| 3 enda röð | Forðastu GC ríkur eða AT ríkur;endastöðin er helst G eða C;best er að forðast T |
| Fylling | Forðastu viðbótarraðir sem eru fleiri en 3 basar innan primersins eða á milli tveggja primera |
| Sérhæfni | Notaðu sprengjuleit til að staðfesta sérhæfni grunns |
①SiRNA er tegundasértækt og raðir mismunandi tegunda verða mismunandi.
②SiRNA er pakkað í frostþurrkað duft, sem hægt er að geyma stöðugt í 2-4 vikur við stofuhita.
2.3 Verkfæri eða hvarfefni sem þarf að útbúa fyrirfram
| Grunnur (innri tilvísun) | Þar á meðal tvö fram og aftur |
| Primers (markgen) | Þar á meðal tvö fram og aftur |
| Target Si RNA (3 ræmur) | Almennt mun fyrirtækið búa til 3 ræmur og velja síðan einn af þremur með RT-PCR |
| Transfection Kit | Lipo2000 osfrv. |
| RNA hraðútdráttarsett | Fyrir RNA útdrátt eftir transfection |
| Rapid Reverse Transcription Kit | fyrir cDNA myndun |
| PCR mögnunarsett | 2×Super SYBR Grænn qPCR Master Mix |
2.4 Varðandi atriðin sem þarf að huga að í sérstökum tilraunaskrefum:
①siRNA transfection ferli
1. Fyrir málun geturðu valið 24-brunn plötu, 12-brunn plötu eða 6-brunn plötu (meðalstyrkur RNA sem lagður er upp á í hverri holu á 24-brunn plötu er um 100-300 ng/uL), og ákjósanlegur transfection þéttleiki frumna er allt að 60% -80% eða svo.
2. Transfection skrefin og sérstakar kröfur eru nákvæmlega í samræmi við leiðbeiningarnar.
3. Eftir sýkingu er hægt að safna sýnum innan 24-72 klukkustunda fyrir mRNA greiningu (RT-PCR) eða próteingreiningu innan 48-96 klukkustunda (WB)
② RNA útdráttarferli
1. Komið í veg fyrir mengun af utanaðkomandi ensímum.Það felur aðallega í sér að nota grímur og hanska stranglega;með því að nota dauðhreinsaða pípettuodda og EP slöngur;vatnið sem notað er í tilrauninni verður að vera RNase-frítt.
2. Mælt er með því að gera tvisvar eins og mælt er fyrir um í hraðútdráttarsettinu, sem mun virkilega bæta hreinleika og afrakstur.
3. Úrgangsvökvinn má ekki snerta RNA súluna.
③ RNA magngreining
Eftir að RNA hefur verið dregið út er hægt að mæla það beint með Nanodrop og lágmarksaflestur getur verið allt að 10ng/ul.
④ Öfugt umritunarferli
1. Vegna mikils næmis RT-qPCR ætti að gera að minnsta kosti 3 samhliða brunna fyrir hvert sýni til að koma í veg fyrir að síðari Ct sé of ólíkt eða SD of stórt fyrir tölfræðilega greiningu.
2. Ekki frysta og þíða Master mix endurtekið.
3. Skipta þarf um hvert rör/gat fyrir nýjan odd!Ekki nota stöðugt sama pípettuoddinn til að bæta við sýnum!
4. Slétta þarf filmuna sem er fest á 96-brunn plötuna eftir að sýninu hefur verið bætt við með plötu.Best er að skilvinda áður en það er sett á vélina þannig að vökvinn á rörveggnum geti flætt niður og fjarlægt loftbólur.
⑤ Algeng ferilgreining
| Ekkert tímabil logaritmísks vaxtar | Hugsanlega hár styrkur sniðmáts |
| Ekkert CT gildi | Rang skref til að greina flúrljómun; niðurbrot primers eða rannsaka - heilleika þess er hægt að greina með PAGE rafdrætti; ófullnægjandi magn af sniðmáti; niðurbrot á sniðmátum – forðast innleiðingu óhreininda og endurtekna frystingu og þíðingu við undirbúning sýna; |
| Ct>38 | Lítil mögnunarvirkni;PCR vara er of löng;ýmsir hvarfþættir brotna niður |
| Línuleg mögnunarferill | Kannar geta brotnað niður að hluta við endurteknar frystingar-þíðingarlotur eða langvarandi útsetningu fyrir ljósi |
| Munurinn á tvíteknum holum er sérstaklega mikill | Hvarflausnin er ekki alveg bráðnuð eða hvarflausnin er ekki blönduð;hitabað PCR tækisins er mengað af flúrljómandi efnum |
2.5 Um gagnagreiningu
Gagnagreiningu qPCR má skipta í hlutfallslega magngreiningu og algera magngreiningu.Til dæmis, frumur í meðferðarhópnum samanborið við frumur í samanburðarhópnum,
Hversu oft mRNA X gensins breytist, þetta er hlutfallsleg magngreining;í ákveðnum fjölda frumna, mRNA af X geninu
Hversu mörg eintök eru, þetta er alger magngreining.Venjulega er það sem við notum mest á rannsóknarstofunni hlutfallslega megindlega aðferðin.Venjulega,2-ΔΔct aðferðiner mest notað í tilraunum og því verður aðeins þessi aðferð kynnt í smáatriðum hér.
2-ΔΔct aðferð: Niðurstaðan sem fæst er munurinn á tjáningu markgensins í tilraunahópnum miðað við markgenið í samanburðarhópnum.Þess er krafist að mögnunarvirkni bæði markgensins og innra viðmiðunargensins sé nálægt 100% og hlutfallslegt frávik ætti ekki að vera meira en 5%.
Reikniaðferðin er sem hér segir:
Δct viðmiðunarhópur = ct gildi markgena í viðmiðunarhópi – ct gildi innra viðmiðunargena í viðmiðunarhópi
Δct tilraunahópur = ct gildi markgensins í tilraunahópnum – ct gildi innra viðmiðunargensins í tilraunahópnum
ΔΔct=Δct tilraunahópur-Δct samanburðarhópur
Að lokum, reiknaðu margfeldið af mismun á tjáningarstigi:
Change Fold=2-ΔΔct (samsvarar excel fallinu er POWER)
Skyldar vörur:
Birtingartími: 20. maí 2023
