一、Auka næmni hvarfkerfisins：

1. Einangraðu hágæða RNA:

Árangursrík cDNA nýmyndun kemur frá hágæða RNA.Hágæða RNA ætti að minnsta kosti að vera í fullri lengd og laust við bakritahemla eins og EDTA eða SDS.Gæði RNA ákvarða hámarksmagn raðupplýsinga sem þú getur umritað í cDNA.Algeng RNA hreinsunaraðferð er eins skrefs aðferð sem notar guanidín ísóþíósýanat/sýrufenól.Til að koma í veg fyrir mengun með snefilmagni af RNase þarf að geyma RNA sem er einangrað úr RNase-ríkum sýnum (eins og brisi) í formaldehýði til að varðveita hágæða RNA, sérstaklega til langtímageymslu.RNA sem dregið var úr rottu lifur var í grundvallaratriðum brotið niður eftir að hafa verið geymt í vatni í eina viku, en RNA sem dregið var úr rottumilta hélst stöðugt eftir að hafa verið geymt í vatni í 3 ár.Auk þess eru afrit sem eru lengri en 4 kb næmari fyrir niðurbroti vegna snefilefna RNasa en lítil afrit.Til að auka stöðugleika geymdra RNA sýna má leysa RNA upp í afjónuðu formamíði og geyma við -70°C.Formamíð sem notað er til að varðveita RNA verður að vera laust við RNA niðurbrotsefni.RNA úr brisi má varðveita í formamíði í að minnsta kosti eitt ár.Þegar þú undirbýr notkun RNA geturðu notað eftirfarandi aðferð til að fella út RNA: Bætið NaCl við 0,2M og 4 sinnum rúmmál etanóls, setjið við stofuhita í 3-5 mínútur og skilið í skilvindu við 10.000×g í 5 mínútur.

2. Notaðu RNaseH-óvirka (RNaseH-) bakritið:

RNasa hemlum er oft bætt við við öfug umritunarviðbrögð til að auka lengd og afrakstur cDNA nýmyndunar.RNasa hemlum ætti að bæta við meðan á fyrstu-strengs nýmyndunarviðbrögðum stendur í viðurvist stuðpúðar og afoxunarefnis (eins og DTT), vegna þess að ferlið fyrir cDNA nýmyndun afeinkar hemillinn og losar þar með bundinn RNase sem getur brotið niður RNA.Prótein RNase hemlar koma aðeins í veg fyrir niðurbrot RNA af RNase A, B, C og koma ekki í veg fyrir RNase á húðinni, svo vertu varkár að koma ekki RNase frá fingrum þínum þrátt fyrir notkun þessara hemla.

Reverse transcriptase hvatar umbreytingu RNA í cDNA.Bæði M-MLV og AMV hafa innræna RNaseH virkni til viðbótar við eigin pólýmerasa virkni.RNaseH virkni og pólýmerasa virkni keppa sín á milli um blendingsstrenginn sem myndast á milli RNA sniðmátsins og DNA grunnsins eða cDNA framlengingarstrengsins og brjóta niður RNA strenginn í RNA:DNA fléttunni.RNA sniðmátið sem er brotið niður af RNaseH virkni getur ekki lengur þjónað sem áhrifaríkt hvarfefni fyrir cDNA nýmyndun, sem dregur úr ávöxtun og lengd cDNA nýmyndunar.Þess vegna væri hagkvæmt að útrýma eða draga verulega úr RNaseH virkni bakrita.。

SuperScript Ⅱ bakrit, RNaseH-MMLV bakrit og thermoScript bakrit, RNaseH-AMV, geta fengið meira magn og meira cDNA í fullri lengd en MMLV og AMV.RT-PCR næmi verður fyrir áhrifum af magni cDNA nýmyndunar.ThermoScript er miklu næmari en AMV.Stærð RT-PCR afurða takmarkast af getu bakrita til að búa til cDNA, sérstaklega þegar stærri cDNA eru klónuð.Í samanburði við MMLV jók SuperScripⅡ verulega ávöxtun langra RT-PCR vara.RNaseH-bakritasinn hefur einnig aukinn hitastöðugleika, þannig að hvarfið er hægt að framkvæma við hærra hitastig en venjulegt 37-42°C.Notaðu oligo(dT) primer og 10 μCi af [α-P]dCTP við efnafræðilegar aðstæður.Heildarafrakstur fyrsta strengs var reiknaður út með TCA útfellingaraðferðinni.cDNA í fullri lengd var greint með því að nota stærðarflokkuð bönd sem skorin voru út og talin á basísku agarósa hlaupi.

3. Hækkaðu ræktunarhitastigið fyrir öfuga umritun:

Hærra ræktunarhitastig hjálpar til við að opna aukabyggingu RNA og eykur afrakstur hvarfsins.Fyrir flest RNA sniðmát mun ræktun á RNA og primerunum við 65°C án biðminni eða salts, fylgt eftir með hraðri kælingu á ís, útrýma flestum efri byggingum og leyfa primers að bindast.Hins vegar hafa sum sniðmát enn aukabyggingu, jafnvel eftir hitaeðlun.Mögnun á þessum erfiðu sniðmátum er hægt að framkvæma með því að nota ThermoScript öfugumrit og setja öfug umritunarviðbrögð við hærra hitastig til að bæta mögnun.Hærra ræktunarhitastig getur einnig aukið sérhæfni, sérstaklega þegar genasértækir frumur (GSP) eru notaðir fyrir cDNA nýmyndun (sjá kafla 3).Ef þú notar GSP skaltu ganga úr skugga um að Tm ræsinganna sé það sama og væntanlegt ræktunarhitastig.Ekki nota oligo(dT) og handahófskennda primera yfir 60°C.Tilviljunarkennd grunnur krefst ræktunar við 25°C í 10 mínútur áður en þeir hækka í 60°C.Auk þess að nota hærra öfugumritunarhitastig er einnig hægt að bæta sérhæfni með því að flytja RNA/primer blönduna beint frá 65°C denaturation hitastiginu yfir í öfugumritunar ræktunarhitastigið og bæta við forhitaðri 2x hvarfblöndu (cDNA hot-start myndun).Þessi nálgun hjálpar til við að koma í veg fyrir millisameindabasapörun sem á sér stað við lægra hitastig.Hægt er að einfalda margfeldisskiptin á hitastigi sem þarf fyrir RT-PCR með því að nota hitauppstreymi.

Tth hitastöðugur pólýmerasi virkar sem DNA pólýmerasi í viðurvist Mg2+ og sem RNA pólýmerasi í viðurvist Mn2+.Það er hægt að halda hita við hámarkshita 65°C.Hins vegar, tilvist Mn2+ við PCR dregur úr tryggð, sem gerir Tth pólýmerasa minna hentugur fyrir mikla nákvæmni mögnun, eins og klónun cDNA.Að auki hefur Tth litla öfugumritunarvirkni, sem dregur úr næmni, og þar sem hægt er að framkvæma öfuga umritun og PCR með einu ensími, er ekki hægt að nota stjórnviðbrögð án öfugumritunar til að bera saman cDNA mögnunarafurðir við mengandi erfðafræðilegt DNA.Mögnunarafurðirnar voru aðskildar.

4. Aukefni sem stuðla að öfugum umritun:

Aukefnum, þar á meðal glýseróli og DMSO, er bætt við fyrstu þráða nýmyndunarhvarfið, sem getur dregið úr stöðugleika kjarnsýru tvístrengsins og leyst aukabyggingu RNA.Hægt er að bæta við allt að 20% glýseróli eða 10% DMSO án þess að hafa áhrif á SuperScript II eða MMLV virkni.AMV þolir einnig allt að 20% glýseról án þess að minnka virkni.Til að hámarka næmni RT-PCR í SuperScriptⅡ öfugumritunarviðbrögðum er hægt að bæta við 10% glýseróli og rækta það við 45°C.Ef 1/10 af öfugum umritunarhvarfaafurðinni er bætt við PCR, þá er styrkur glýseróls í mögnunarhvarfinu 0,4%, sem er ekki nóg til að hamla PCR.

5. RNaseH skemmtun:

Meðhöndlun á viðbrögðum við myndun cDNA með RNaseH fyrir PCR getur aukið næmi.Fyrir sum sniðmát er talið að RNA í cDNA myndun hvarfsins komi í veg fyrir bindingu mögnunarafurða, en þá getur RNaseH meðferð aukið næmi.Almennt er RNaseH meðferð nauðsynleg þegar verið er að magna upp lengri cDNA marksniðmát í fullri lengd, svo sem berklaskeri II í litlu magni.Fyrir þetta erfiða sniðmát, jók RNaseH meðferð merkið framleitt með SuperScript II eða AMV-smíðuðu cDNA.Fyrir flest RT-PCR viðbrögð er RNaseH meðferð valfrjáls, vegna þess að PCR denaturation þrepið við 95°C vatnsrofir venjulega RNA í RNA:DNA flókinu.

6. Endurbætur á litlum RNA greiningaraðferð:

RT-PCR er sérstaklega krefjandi þegar aðeins lítið magn af RNA er tiltækt.Glýkógen bætt við sem burðarefni við einangrun RNA hjálpar til við að auka afrakstur lítilla sýna.Hægt er að bæta við RNase-fríu glýkógeni á sama tíma og Trizol er bætt við.Glýkógen er vatnsleysanlegt og hægt að geyma það í vatnsfasanum með RNA til að aðstoða við síðari útfellingu.Fyrir sýni sem eru minna en 50 mg af vefjum eða 106 ræktaðar frumur er ráðlagður styrkur RNase-frís glýkógens 250 μg/ml.

Að bæta asetýleruðu BSA við öfug umritunarhvörf með því að nota SuperScript II getur aukið næmið og fyrir lítið magn af RNA getur það aukið greiningarstigið með því að minnka magn SuperScript II og bæta við 40 einingum af RNaseOut núkleasahemli.Ef glýkógen er notað í RNA einangrunarferlinu er samt mælt með því að bæta við BSA eða RNase hemli þegar SuperScript II er notað fyrir öfug umritunarviðbrögð.

二、 Auka RT-PCR sérhæfni

1. CND ómyndun:

Fyrsta strengs cDNA nýmyndun er hægt að hefja með því að nota þrjár mismunandi aðferðir, hlutfallsleg sérhæfni þeirra hefur áhrif á magn og gerð cDNA sem er búið til.

Random primer aðferðin var minnst sértæk af aðferðunum þremur.Primers sameinast á mörgum stöðum í umritinu og mynda stutt cDNA að hluta.Þessi aðferð er oft notuð til að fá 5′ enda raðir og til að fá cDNA úr RNA sniðmátum með svæðum með efri byggingu eða með stöðvunarstöðum sem ekki er hægt að endurtaka með bakriti.Til að fá lengsta cDNA þarf að ákvarða hlutfall primers og RNA í hverju RNA sýni með reynslu.Upphafsstyrkur handahófskenndra primera var á bilinu 50 til 250 ng á 20 μl hvarf.Þar sem cDNA sem er búið til úr heildar-RNA með því að nota handahófskennda frumur er fyrst og fremst ríbósómal RNA, er pólý(A)+RNA almennt valið sem sniðmát.

Oligo(dT) primers eru sértækari en tilviljunarkenndir primers.Það blandar saman við poly(A) hala sem finnast í 3′ enda flestra heilkjörnunga mRNA.Vegna þess að pólý(A)+ RNA er um það bil 1% til 2% af heildar-RNA, er magn og flókið cDNA mun minna en með tilviljunarkenndum primerum.Vegna mikillar sértækni krefst oligo(dT) almennt ekki hagræðingar á hlutfalli RNA og primers og pólý(A)+ vals.Mælt er með því að nota 0,5μg oligo(dT) fyrir hvert 20μl hvarfkerfi.oligo(dT)12-18 hentar flestum RT-PCR.ThermoScript RT-PCR kerfið býður upp á oligo(dT)20 vegna betri hitastöðugleika fyrir hærra ræktunarhitastig.

Genasértækir frumrar (GSP) eru sértækustu frumarnir fyrir öfuga umritunarskrefið.GSP er andsense fákimur sem getur blandað sér sérstaklega við RNA markröðina, ólíkt tilviljunarkenndum frumurum eða oligo(dT), sem tengja saman við öll RNA.Sömu reglur og notaðar eru til að hanna PCR primera gilda um hönnun GSP í öfugum umritunarviðbrögðum.GSP getur verið sama röð og mögnunar grunnurinn sem tengir við 3'-enda mRNA, eða GSP getur verið hannað til að sameina niðurstreymis öfu mögnunar grunninn.Hjá sumum mögnuðum einstaklingum þarf að hanna fleiri en einn andsense primer fyrir árangursríka RT-PCR vegna þess að aukabygging mark-RNA getur komið í veg fyrir bindingu primer.Mælt er með því að nota 1 pmol andsense GSP í 20 μl fyrsta strengs nýmyndunarviðbrögðum.

2. Hækkaðu ræktunarhitastigið fyrir öfuga umritun:

Til þess að nýta fullan kostinn af GSP sérhæfni ætti að nota bakrit með meiri hitastöðugleika.Hægt er að rækta hitaþolna bakrita við hærra hitastig til að auka viðbragðsþröng.Til dæmis, ef GSP glæðir við 55°C, mun sérhæfni GSP ekki nýtast að fullu ef AMV eða M-MLV er notað fyrir öfuga umritun við lága ströngleika 37°C.Hins vegar er hægt að bregðast við SuperScript II og ThermoScript við 50°C eða hærri, sem mun útrýma ósértækum vörum sem myndast við lægra hitastig.Til að fá hámarks sérhæfni er hægt að flytja RNA/primer blönduna beint frá 65°C denaturation hitastigi yfir í öfugumritunar ræktunarhitastig og bæta við forhitaða 2x hvarfblöndu (cDNA nýmyndun heit byrjun).Þetta hjálpar til við að koma í veg fyrir millisameindabasapörun við lágt hitastig.Hægt er að einfalda margar hitabreytingar sem krafist er fyrir RT-PCR með því að nota hitauppstreymi.

3. Dregur úr erfðafræðilegri DNA mengun:

Hugsanlegir erfiðleikar sem koma upp við RT-PCR er mengun erfðafræðilegs DNA í RNA.Notkun góðrar RNA einangrunaraðferðar, eins og Trizol Reagent, mun draga úr magni erfðaefnis DNA sem mengar RNA efnablönduna.Til að forðast vörur sem unnar eru úr erfðafræðilegu DNA er hægt að meðhöndla RNA með mögnunargráðu DNase I til að fjarlægja mengandi DNA áður en umritun er öfug.DNase I meltingu var hætt með því að rækta sýnin í 2,0 mM EDTA í 10 mínútur við 65°C.EDTA getur klóað magnesíumjónir, komið í veg fyrir magnesíumjónaháð RNA vatnsrof við háan hita.

Til þess að aðskilja magnað cDNA frá mengandi erfðafræðilegum DNA mögnunarafurðum er hægt að hanna primera sem hver um sig sameinast að aðskildum exonum.PCR vörur unnar úr cDNA verða styttri en þær sem unnar eru úr menguðu erfðaefni DNA.Að auki var viðmiðunartilraun án öfugumritunar gerð á hverju RNA sniðmáti til að ákvarða hvort tiltekið brot væri dregið úr erfðafræðilegu DNA eða cDNA.PCR afurðin sem fæst án öfugumritunar er fengin úr erfðamenginu.