Sem nýr á rannsóknarstofunni er ekki gott starf að skima út jákvæðar plöntur úr fullt af plöntum með lágt umbreytingarhlutfall.Í fyrsta lagi þarf að draga DNA úr miklum fjölda sýna eitt í einu og síðan verða erlendu genin greind með PCR.Hins vegar eru niðurstöðurnar oft eyður og bönd með nokkrum hlutum einstaka sinnum, en það er ómögulegt að ákvarða hvort það sé týnd skynjun eða ranggreining..Er það mjög hjálparlaust að horfast í augu við slíkt tilraunaferli og niðurstöður?Ekki hafa áhyggjur, bróðir kennir þér hvernig á að skima út erfðabreyttar jákvæðar plöntur auðveldlega og nákvæmlega.

Skref 1

Hönnunargreiningar grunnur

Ákvarða innræna genið og utanaðkomandi genið sem á að greina samkvæmt sýninu sem á að prófa og veldu dæmigerða 100-500bp röð í geninu fyrir grunnhönnun.Góðir primers geta tryggt nákvæmni greiningarniðurstaðna og stytt greiningartímann (sjá viðauka fyrir algenga greiningarprimera).

Tilkynning: Nýhönnuðu grunnarnir þurfa að hámarka hvarfaðstæður og sannreyna nákvæmni, nákvæmni og greiningarmörk uppgötvunarinnar fyrir uppgötvun í stórum stíl.

Skref 2

Hönnun tilraunasamskiptareglur

Jákvæð stjórn: Notaðu hreinsað DNA sem inniheldur markbútið sem sniðmát til að ákvarða hvort PCR hvarfkerfi og aðstæður séu eðlilegar.

Neikvætt/eyða eftirlit: Notaðu DNA sniðmátið eða ddH2O sem inniheldur ekki markbútið sem sniðmát til að greina hvort uppspretta mengunar sé í PCR kerfinu.

Innri viðmiðunarstýring: notaðu primer/probe samsetningu innræna gensins í sýninu sem á að prófa til að meta hvort hægt sé að greina sniðmátið með PCR.

Tilkynning:

Stilla skal jákvætt, neikvætt/eyðueftirlit og innra eftirlit fyrir hvert próf til að meta réttmæti tilraunaniðurstaðna.

Undirbúningur tilrauna

Fyrir notkun skal athuga hvort lausnin sé jafnt blandað.Ef úrkoma finnst þarf að leysa hana upp og blanda saman samkvæmt leiðbeiningum fyrir notkun.Pípetta þarf 2×PCR blönduna og blanda ítrekað með örpípettu fyrir notkun til að forðast ójafna jónadreifingu.

Tilkynning:

Taktu út handbókina og lestu hana vandlega og gerðu undirbúning fyrir tilraunina í ströngu samræmi við kröfur handbókarinnar.

Skref 4

Undirbúa PCR hvarfkerfi

Samkvæmt tilraunaaðferðinni skaltu blanda grunnunum, H2O og 2×PCR blöndunni jafnt, skilvindu og dreift þeim í hvert hvarfglas.

Tilkynning:

Fyrir umfangsmiklar eða langtímaprófanir er mælt með því að nota PCR hvarfkerfi sem inniheldur UNG ensím, sem getur í raun komið í veg fyrir úðabrúsamengun af völdum PCR vara.

Skref 5

Bættu við viðbragðssniðmáti

Með því að nota Direct PCR tækni er engin þörf á leiðinlegu kjarnsýruhreinsunarferli, hægt er að útbúa sýnissniðið innan 10 mínútna og bæta við samsvarandi PCR hvarfkerfi.

Tilkynning:

Klofnunaraðferðin hefur betri greiningaráhrif og hægt er að nota vöruna sem fæst fyrir mörg greiningarviðbrögð.

5.1: Bein stækkun laufblaða

Í samræmi við stærð myndarinnar í handbókinni skaltu skera blaðvefinn með 2-3 mm þvermál og setja hann í PCR hvarfkerfið.

Athugið: Gakktu úr skugga um að blaðabrotin séu alveg á kafi í PCR hvarflausninni og bætið ekki við of miklum blaðvef.

5.2: Laufskiptingsaðferð

Skerið blaðvefinn með 5-7 mm þvermál og setjið hann í skilvindurör.Ef þú velur þroskuð lauf, vinsamlegast forðastu að nota vefi aðalæð blaðsins.Pípettaðu 50ul Buffer P1 lýsat inn í skilvindurör til að tryggja að lýsatið geti sokkið blaðvefinn alveg í kaf, settu það í varmahringrás eða málmbað og lýsið við 95°C í 5-10 mínútur.

Bætið við 50ul Buffer P2 hlutleysunarlausn og blandið vel saman.Hægt er að nota lýsatið sem myndast sem sniðmát og bæta við PCR hvarfkerfið.

Athugið: Magn sniðmáts er á milli 5-10% af PCR kerfinu og ætti ekki að fara yfir 20% (til dæmis, í 20μl PCR kerfi, bætið við 1-2μl af leysislausn, ekki meira en 4μl).

Skref 6

PCR viðbrögð

Eftir skilvindu PCR hvarfrörsins er það sett í PCR tæki til mögnunar.

Tilkynning:

Hvarfið notar óhreinsað sniðmát til mögnunar, þannig að fjöldi mögnunarlota er 5-10 fleiri lotur en þegar hreinsað DNA sniðmát er notað.

Skref 7

Uppgötvun raforku og niðurstöðugreiningu

M: 100bp DNA stigi

1\4: Hreinsað DNA aðferð

2\5: Bein PCR aðferð

3\6: Autt stjórn

QC:

Prófunarniðurstöður hinna ýmsu stýriefna sem settar eru í tilraunina ættu að uppfylla eftirfarandi skilyrði.Annars ætti að greina orsök vandamálsins og framkvæma prófið aftur eftir að vandamálið er útrýmt.

Tafla 1. Eðlilegar niðurstöður prófa ýmissa samanburðarhópa

*Þegar plasmíðið er notað sem jákvæð viðmiðun getur niðurstaða innrænna genaprófsins verið neikvæð

Úrslitadómur:

A. Prófunarniðurstaða innræna gensins í sýninu er neikvæð, sem gefur til kynna að DNA sem hentar fyrir venjulega PCR greiningu er ekki hægt að draga úr sýninu eða útdregna DNAið inniheldur PCR viðbragðshemla og DNA ætti að draga út aftur.

B. Prófunarniðurstaða innræna gens sýnisins er jákvæð og prófunarniðurstaða utanaðkomandi gens er neikvæð, sem gefur til kynna að DNA sem hentar fyrir venjulega PCR greiningu sé dregið úr sýninu og má dæma að XXX genið greinist ekki í sýninu.

C. Prófunarniðurstaða innræna gens sýnisins er jákvæð og prófunarniðurstaða utanaðkomandi gens er jákvæð, sem gefur til kynna að DNA sem hentar fyrir venjulega PCR greiningu hafi verið dregið úr sýninu og DNA sýnisins inniheldur XXX genið.Staðfestingartilraunir má framkvæma frekar.

Skref 8

Hönnunargreiningar grunnur

Eftir tilraunina skaltu nota 2% natríumhýpóklórítlausn og 70% etanóllausn til að þurrka tilraunasvæðið til að koma í veg fyrir umhverfismengun.