COVID-19 er smitsjúkdómur af völdum alvarlegs bráðs öndunarfæraheilkennis Coronavirus Tegund 2. Þegar einstaklingur er sýktur eru algengustu einkennin hiti, hósti og mæði.

Sýnin sem notuð eru til prófunar má safna með þurrk úr nefkoki eða munnkoki.

Hvað er PCR?

Staðlaða aðferðin við uppgötvun kransæðaveiru er pólýmerasa keðjuverkun, PCR.Þetta er aðferð sem er mikið notuð í sameindalíffræði.Það getur fljótt afritað milljónir til milljarða tiltekinna DNA-búta.

Nýja kórónavírusinn inniheldur mjög langt einþátta RNA erfðamengi.Til þess að greina þessar veirur með PCR þarf að breyta RNA sameindum í sambótar DNA raðir sínar með öfugum umriti og síðan er hægt að magna upp nýmyndað DNA með stöðluðum PCR aðferðum, sem er almennt þekkt sem RT-PCR.

RT-PCR ferli

RNA útdráttur

Til að framkvæma þessa aðferð ætti í grundvallaratriðum að draga út veiru-RNA.Hægt er að nota margs konar RNA hreinsunarsett fyrir þægilegan, fljótan og árangursríkan aðskilnað.

Til að draga út veiru-RNA með því að nota verslunarsett, bætið sýninu fyrst í örskilvindurör og blandið því síðan saman við lýsispúðann.Þessi stuðpúði er mjög eðlislægur og samanstendur venjulega af fenóli og guanidínísóþíósýanati.Að auki eru RNasa hemlar venjulega til staðar í lýsisbuffi til að tryggja einangrun ósnorts veiru RNA.

Eftir að lysisbuffinu hefur verið bætt við, hringið í blöndunarrörið með púls og ræktað við stofuhita.Veiran er síðan lýsuð við mjög eðlismengandi aðstæður sem lýsisbuffinn veitir.

Eftir að sýnið hefur verið lýst er skilvindurör notað við hreinsunarferlið.Sýnið er sett í skilvindurörið og síðan skilið í skilvindu.

Þessi aðferð er fastfasa útdráttaraðferð þar sem kyrrstæðu fasinn samanstendur af kísilgelgrunni.

Við bestu salt- og pH aðstæður bindast RNA sameindir kísilhimnunni.

Á sama tíma eru prótein og önnur aðskotaefni fjarlægð.

Eftir skilvindu skaltu setja skilvindurörið í hreint söfnunarrör, farga síuvökvanum og síðan bæta við þvottajafna.

Setjið túpuna aftur í skilvinduna til að þrýsta þvottabuffinu í gegnum himnuna.Þetta mun fjarlægja öll óhreinindi sem eftir eru af himnunni, þannig að aðeins RNA er bundið við kísilhlaupið.

Eftir að sýnið hefur verið þvegið, settu túpuna í hreint örskilvinduglas og bættu skolunarpúðanum við.

Það er síðan skilið í skilvindu til að þvinga skolunarjafna í gegnum himnuna.Skolunarbuffinn fjarlægir veiru-RNA úr snúningssúlunni og fær hreinsað RNA laust við prótein, hemla og önnur aðskotaefni.

SKREF 2

Blandað þykkni

Eftir að veiru-RNA hefur verið dregið út er næsta skref að undirbúa hvarfblönduna fyrir PCR mögnun.Í þessu skrefi er þykkni notað.Þessi óblandaða lausn er forblanduð óblandaðri lausn sem samanstendur af forblöndu, öfugum transkriptasa, núkleótíðum, áframhaldandi grunni, öfugum grunni, TaqMan rannsaka og DNA pólýmerasa.

Að lokum, til að klára þessa hvarfblöndu, er RNA sniðmátinu bætt við.Glösunum er blandað saman með púlshringingu og síðan er hvarfblöndunni hlaðið í PCR plötuna.PCR platan inniheldur venjulega 96 holur og getur greint mörg sýni á sama tíma.

SKREF 3

PCR mögnun

Næst skaltu setja plötuna í PCR vélina, sem er í raun hitauppstreymi.

Rauntíma RT-PCR er notað til að greina 2019 skáldsögu kórónavírussins með því að magna upp markröðina í RdrRP geninu, E geninu og N geninu.Val á markgeni er háð grunni og rannsakaröð.

Fyrsta skref RT-PCR er öfug umritun.Fyrsti þráðurinn af complementary DNA er myndaður, sem er hafin af PCR reverse primer, sem binst við complementary hluta veiru RNA erfðamengisins.Síðan bætir öfugritun DNA núkleótíðum við 3′enda primersins til að búa til DNA sem er viðbót við veiru-RNA.Hitastig og lengd þessa skrefs fer eftir primerum, mark-RNA og öfugumritasa sem notaður er.

Því næst er frumeðlunarskref beitt, sem leiðir til afeðlunar á RNA-DNA blendingnum.Þetta skref er nauðsynlegt til að virkja DNA pólýmerasann.Á sama tíma óvirkur öfugur transkriptasi.

PCR samanstendur af röð af varmalotum.Hver hringrás samanstendur af afeitrun, glæðingu og framlengingu.

Eðlunarskrefið felur í sér að hita hvarfhólfið í 95 gráður á Celsíus og nota það til að denaturation á tvíþátta DNA sniðmátinu.

Í næsta skrefi er hvarfhitastigið lækkað í 58 gráður á Celsíus, sem gerir áframhaldandi grunni kleift að sameinast við viðbótarhluta einþátta DNA sniðmátsins.Hitastig hitastigsins fer beint eftir lengd og samsetningu grunnsins.

Í framlengingarskrefinu myndar DNA-pólýmerasinn nýjan DNA-streng sem er viðbót við DNA-sniðmátstrenginn.Með því að bæta við frjálsum kjarna sem eru viðbót við sniðmátið í 5′ til 3′ átt frá hvarfblöndunni.Hitastig þessa skrefs fer eftir DNA-pólýmerasanum sem notaður er.

Eftir fyrstu lotu fæst tvíþátta DNA mark.

Farðu síðan inn í seinni lotuna.Tvíþátta DNAið er eðlisbreytt til að framleiða tvær einþátta DNA sameindir.

Í næsta skrefi er efnahvarfshitastigið lækkað, primerarnir eru tengdir við hvert einþátta DNA sniðmát og Taq-man rannsakað er tengt við viðbótarhluta mark-DNA.

TaqMan rannsakandinn samanstendur af flúorófóri sem er samgilt tengdur við 5' enda fákjarna rannsakans.Þegar hann er spenntur af ljósgjafa hringrásartækisins gefur flúorfórinn frá sér flúrljómun.Að auki er rannsakarinn samsettur úr slokknara í 3′endanum.Nálægð skýrslugensins við quencher kemur í veg fyrir greiningu á flúrljómun.

Í framlengingarskrefinu myndar DNA-pólýmerasinn nýjan streng.Þegar pólýmerasinn nær til TaqMan rannsakans, klýfur innræn 5'núkleasavirkni hans rannsakann og aðskilur litarefnið frá slokknaranum.

Með hverri PCR lotu losna fleiri litarefnissameindir, sem leiðir til aukningar á flúrljómunarstyrk í réttu hlutfalli við fjölda amplikóna sem myndast.

Þessi aðferð gerir kleift að meta fjölda tiltekinnar röð sem er til staðar í sýninu.Fjöldi tvíþátta DNA brota tvöfaldast í hverri lotu.Þess vegna er hægt að nota PCR til að greina mjög lítil sýni.

Til að mæla flúrljós, wolfram halógen lampa, örvunarsíu, endurskinsmerki, linsu, útblásturssíu og hleðslutengda CCD myndavél.

SKREF 4 Finndu

Til að mæla flúrljós, wolfram halógen lampa, örvunarsíu, endurskinsmerki, linsu, útblásturssíu og hleðslutengda CCD myndavél.

Síaða ljósið frá lampanum endurkastast af endurkastinu, fer í gegnum eimsvalarlinsuna og er beint að miðju hvers gats.Þá endurkastast flúrljómunin sem gefin er út frá gatinu frá speglinum, fer í gegnum útblásturssíuna og greinist af CCD myndavélinni.Í hverri PCR lotu er hægt að greina sjálfspennt flúorófór ljós með CCD.

Það breytir ljósinu í stafræn gögn.Þessi aðferð er kölluð rauntíma PCR, og hún gerir rauntíma eftirlit með framvindu PCR viðbragða.