PCR (pólýmerasa keðjuverkun) er ein af in vitro DNA mögnunartækni, með sögu um meira en 30 ár.

PCR tækni var frumkvöðull af Kary Mullis frá Cetus, Bandaríkjunum árið 1983. Mullis sótti um PCR einkaleyfi árið 1985 og gaf út fyrstu PCR fræðilegu ritgerðina um vísindi sama ár.Mullis hlaut Nóbelsverðlaunin í efnafræði árið 1993 fyrir verk sín.

Grunnreglur PCR

PCR getur magnað mark DNA brot um meira en eina milljón sinnum.Meginreglan er undir hvatningu á DNA pólýmerasa, með því að nota móðurstrengs DNA sem sniðmát og sérstakan grunn sem upphafspunkt fyrir framlengingu.Það er endurtekið in vitro með skrefum eins og eðlisbreytingu, glæðingu og framlengingu.Ferlið dótturstrengs DNA sem er viðbót við móðurstrengssniðmát DNA.

Hið staðlaða PCR ferli er skipt í þrjú skref:

1.Denaturation: Notaðu háan hita til að aðskilja DNA tvíþræði.Vetnistengi milli DNA tvíþráða er rofið við háan hita (93-98 ℃).

2. Glæðing: Eftir að tvíþátta DNA er aðskilið skal lækka hitastigið þannig að grunnurinn geti bundist einþátta DNA.

3. Framlenging: DNA pólýmerasinn byrjar að búa til viðbótarþræði meðfram DNA þráðunum úr primerunum sem eru bundnir þegar hitastigið er lækkað.Þegar framlengingunni er lokið er hringrás lokið og fjöldi DNA-búta tvöfaldast

Með því að endurtaka þessi þrjú skref 25-35 sinnum mun fjöldi DNA búta aukast veldisvísis.

Snilldin við PCR er að hægt er að hanna mismunandi primera fyrir mismunandi markgen, þannig að hægt er að magna brot af markgenum á stuttum tíma.

Hingað til er hægt að skipta PCR í þrjá flokka, nefnilega venjulegt PCR, flúrljómandi magn PCR og stafrænt PCR.

Fyrsta kynslóð venjulegs PCR

Notaðu venjulegt PCR mögnunartæki til að magna upp markgenið og notaðu síðan agarósa gel rafdrætti til að greina vöruna, aðeins er hægt að gera eigindlega greiningu.

Helstu ókostir fyrstu kynslóðar PCR:

1. Tilhneigingu til ósértækrar mögnunar og rangar jákvæðar niðurstöður.

2. Uppgötvunin tekur langan tíma og aðgerðin er fyrirferðarmikil.

3. Aðeins er hægt að gera eigindlegt próf

Önnur kynslóð rauntíma PCR

Rauntíma PCR, einnig þekkt sem qPCR, notar flúrljómunarnema sem geta gefið til kynna framvindu hvarfkerfisins, og fylgist með uppsöfnun magnaðra vara með uppsöfnun flúrljómunarmerkja og dæmir niðurstöðurnar í gegnum flúrljómunarferilinn.Það er hægt að mæla það með hjálp Cq gildis og staðalferils.

Vegna þess að qPCR tæknin er framkvæmd í lokuðu kerfi minnka líkurnar á mengun og hægt er að fylgjast með flúrljómunarmerkinu fyrir magngreiningu, þannig að það er mest notað í klínískri framkvæmd og hefur orðið ríkjandi tækni í PCR.

Hægt er að skipta flúrljómandi efnum sem notuð eru í rauntíma flúrljómandi magni PCR í: TaqMan flúrljómun, sameindaljós og flúrljómandi litarefni.

1) TaqMan flúrljómun:

Meðan á PCR mögnun stendur er sérstökum flúrljómandi nema bætt við á meðan pari af grunni er bætt við.Nefndin er fákirni og báðir endar eru merktir með skýrsluflúrljómandi hópi og quencher flúrljómandi hópi.

Þegar rannsakandinn er ósnortinn, frásogast flúrljómandi merkið sem blaðamannahópurinn gefur frá sér af slökkvihópnum;meðan á PCR mögnun stendur, klýfur 5′-3′ exonuclease virkni Taq ensímsins og rýfur rannsakann, sem gerir reporter flúrljómandi hópinn og deyfingu. cence merki er algjörlega samstillt við myndun PCR vörunnar.

2) SYBR flúrljómandi litarefni:

Í PCR hvarfkerfinu er ofgnótt af SYBR flúrljómandi litarefni bætt við.Eftir að SYBR flúrljómandi liturinn er ósértækur felldur inn í DNA tvístrenginn gefur það frá sér flúrljómandi merki.SYBR litarefni sameindarinnar sem er ekki felld inn í keðjuna mun ekki gefa frá sér nein flúrljómandi merki og tryggir þar með flúrljómunarmerkið. Aukningin á PCR vörum er algjörlega samstillt við aukningu á PCR vörum.SYBR binst aðeins tvíþátta DNA og því er hægt að nota bræðsluferilinn til að ákvarða hvort PCR viðbrögðin séu sértæk.

3) Sameindaviti:

Það er stofnlykkja tvímerkt fákjarnanemi sem myndar hárnálabyggingu sem er um það bil 8 basar við 5 og 3 endana.Kjarnsýruraðirnar í báðum endum eru pöruð saman, sem veldur því að flúrljómandi hópurinn og slökkvihópurinn eru þéttir.Lokið, engin flúrljómun myndast.

Eftir að PCR afurðin er mynduð, á meðan á glæðingarferlinu stendur, er miðhluti sameindavitans paraður við ákveðna DNA röð og flúrljómandi genið er aðskilið frá quencher geninu til að framleiða flúrljómun.

Helstu ókostir annarrar kynslóðar PCR:

Næmni er enn ábótavant og uppgötvun lítilla eintaka er ónákvæmur.

Það eru áhrif frá bakgrunnsgildinu og niðurstaðan er næm fyrir truflunum.

Þegar PCR hemlar eru í hvarfkerfinu eru niðurstöðurnar næmar fyrir truflunum.

Þriðja kynslóð stafræns PCR

Stafræn PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) reiknar út afritsnúmer markröðarinnar með endapunktagreiningu og getur framkvæmt nákvæma algera magngreiningu án þess að nota innra eftirlit og staðlaða ferla.

Stafræn PCR notar endapunktagreiningu og er ekki háð Ct gildinu (hringrásarþröskuldi), þannig að stafræn PCR viðbrögð verða minna fyrir áhrifum af mögnunarvirkni og þol fyrir PCR viðbragðshemlum er bætt, með mikilli nákvæmni og endurgerðanleika.

Vegna eiginleika mikillar næmni og mikillar nákvæmni er það ekki auðveldlega truflað af PCR viðbragðshemlum og það getur náð raunverulegri algerri magngreiningu án staðlaðra vara, sem hefur orðið rannsóknar- og notkunarsvæði.

Samkvæmt mismunandi formum hvarfeiningarinnar má skipta henni í þrjár megingerðir: örvökvakerfi, flísakerfi og dropakerfi.

1) Microfluidic digital PCR, mdPCR:

Byggt á örvökvatækninni er DNA sniðmátið aðskilið.Örvökvatæknin getur gert sér grein fyrir nanóuppfærslu sýnisins eða myndun smærri dropa, en droparnir þurfa sérstaka aðsogsaðferð og síðan sameinuð PCR viðbragðskerfinu.mdPCR hefur smám saman verið samþykkt með öðrum aðferðum í stað.

2) Stafræn PCR sem byggir á dropum, ddPCR:

Notaðu vatn-í-olíu dropamyndunartækni til að vinna úr sýninu í dropa og skiptu hvarfkerfinu sem inniheldur kjarnsýrusameindir í þúsundir nanóskala dropa, sem hver um sig inniheldur ekki kjarnsýrumarksameindina sem á að greina, eða inniheldur eina til nokkrar kjarnsýrumarksameindir sem á að prófa.

3) Chip-undirstaða stafræn PCR, cdPCR:

Notaðu samþætta vökvabrautartækni til að grafa mörg örrör og örhola á kísilskífur eða kvarsgler og stjórna flæði lausnarinnar í gegnum mismunandi stýriloka og skiptu sýnisvökvanum í nanómetra af sömu stærð í hvarfholurnar fyrir stafræna PCR viðbrögð til að ná algerri magngreiningu.

Helstu ókostir þriðju kynslóðar PCR:

Búnaðurinn og hvarfefnin eru dýr.

Gæðakröfur sniðmátsins eru miklar.Ef sniðmátsmagnið fer yfir magn örkerfisins verður ómögulegt að mæla það og ef það er of lítið mun magngreiningarnákvæmni minnka.

Rangar jákvæðar geta einnig myndast þegar það er ósértæk mögnun.