PCR er mest notaða kjarnsýrumögnunartæknin og er mikið notuð vegna næmis hennar og sértækni.Hins vegar, PCR krefst endurtekinnar hitauppstreymis og getur ekki losnað við takmarkanir þess að treysta á tæki og búnað, sem takmarkar notkun þess í klínískum vettvangsprófum.

Frá því snemma á tíunda áratugnum hafa margar rannsóknarstofur byrjað að þróa stöðuga hitamögnunartækni sem krefst ekki hitauppstreymis.Nú hafa þeir þróað lykkjumiðlaða jafnvarma mögnunartækni, þráðaskipta jafnvarma mögnunartækni, hringlaga jafnhita mögnunartækni og kjarnsýruröð háð.Jafnhitamögnunartækni og önnur tækni. 

Loop-miðluð jafnvarma mögnun

Mögnunarreglan byggir á því að DNA er í kviku jafnvægisástandi við um 65°C.Þegar einhver grunnur er basapöraður og framlengdur í viðbótahluta tvíþátta DNA, mun hinn strengurinn sundrast og verða einþátta.

Við þetta hitastig notar DNA 4 sértæka primera til að treysta á DNA-fjölliða tilfærslu strengja til að láta myndun DNA tilfærslu DNA fara stöðugt í sjálfstraust.

Ákvarðu fyrst 6 sértæku svæðin F3, F2, F1, B1, B2, B3 á markgeninu og hannaðu síðan 4 primera byggða á þessum 6 tilteknu svæðum (eins og sýnt er á myndinni hér að neðan):

Fremri innri grunnurinn (FIP) er samsettur úr F1c og F2.

Afturábak innri grunnurinn (BIP) er samsettur úr B1c og B2 og TTTT er notað sem spacer í miðjunni.

Ytri frumarnir F3 og B3 eru í sömu röð samsettir úr F3 og B3 svæðum á markgeninu.

Í LAMP hvarfkerfinu er styrkur innri grunnsins nokkrum sinnum meiri en ytri grunnurinn.Innri grunnurinn er fyrst sameinaður við sniðmátstrenginn til að búa til viðbótarstreng til að mynda DNA tvíþráð.Í kjölfarið er ytri grunnurinn sameinaður við sniðmátstrenginn til að mynda DNA tvíþráð.Undir verkun BstDNA pólýmerasa losnar viðbótastrengurinn sem myndaður er af innri grunninum.Eftir röð af viðbrögðum myndar viðbótarstrengurinn að lokum einn DNA streng með lóðabyggingu.

Einstrengur DNA einstrengurinn sjálfur er notaður sem sniðmát til að mynda stöðugt bráðabirgðastöngullykkja DNA með opnum enda.Innri og ytri primerarnir leiða DNA til að gangast stöðugt undir þræði tilfærslu og framlengingu og mynda að lokum margar stofnlykkjabyggingar með mismunandi lengd.DNA blanda.

Kostir og gallar við lykkjumiðlaða jafnvarma mögnun

Kostir LAMPA:

(1) Mikil mögnunarvirkni, sem getur í raun magnað 1-10 eintök af markgeninu innan 1 klst., og mögnunarvirknin er 10-100 sinnum meiri en venjuleg PCR.

(2) Viðbragðstíminn er stuttur, sértæknin er sterk og engin sérstök búnaður er nauðsynlegur.

Gallar LAMPA:

(1) Kröfurnar til grunna eru sérstaklega miklar.

(2) Ekki er hægt að nota mögnuðu vöruna til klónunar og raðgreiningar, heldur er aðeins hægt að nota hana til að meta.

(3) Vegna mikils næmni þess er auðvelt að mynda úðabrúsa, sem veldur fölskum jákvæðum og hefur áhrif á prófunarniðurstöðurnar.

Sþráðfærslumögnun

Strand displacement amplification (SDA) er in vitro jafnhita DNA mögnunartækni sem byggir á ensímhvarfi sem bandaríski fræðimaðurinn Walker lagði fyrst fram árið 1992.

Grunnkerfi SDA inniheldur takmarkaðan endonucleasa, DNA pólýmerasa með strengjafærsluvirkni, tvö pör af primerum, dNTP, og kalsíum- og magnesíumjónir og jafnakerfi.

Meginreglan um mögnun strengjatilfærslu byggir á efnafræðilega breyttu takmörkunarendonucleasa greiningarröðinni á báðum endum mark-DNA.Endonucleasi opnar bilið í DNA strengnum á greiningarstað þess og DNA fjölliðurinn framlengir bilið 3′ enda og kemur í stað næsta DNA strengs.

Hægt er að sameina staka DNA-þræðina sem skipt er um með primerum og lengja í tvíþræði með DNA-pólýmerasa.Þetta ferli er endurtekið stöðugt, þannig að markröðin magnast upp á skilvirkan hátt.

Kostir og gallar við mögnunartækni fyrir tilfærslu strengja

Kostir SDA:

Mögnunarvirknin er mikil, viðbragðstíminn er stuttur, sértæknin er sterk og engin sérstök búnaður er nauðsynlegur.

Gallar SDA:

Vörurnar eru ekki einsleitar og sumar einþátta og tvíþátta vörur eru alltaf framleiddar í SDA hringrásinni og skottið verður óhjákvæmilega þegar það greinist með rafdrætti.

Rolling hring mögnun

Rolling circle amplification (RCA) er lögð til með því að nota aðferðina við að afrita DNA úr sjúkdómsvaldandi lífverum með rúllandi hring.Það vísar til notkunar á einþátta hringlaga DNA sem sniðmát við stöðugt hitastig og sérstakan DNA pólýmerasa (eins og Phi29) ) Undir virkni rúllandi hrings DNA myndun til að ná mögnun markgensins.

RCA má skipta í línulega mögnun og veldisvísis mögnun.Skilvirkni línulegs RCA getur náð 10⁵sinnum, og skilvirkni veldisvísis RCA getur náð 10⁹sinnum.

Einfaldur greinarmunur, eins og sést á myndinni hér að neðan, línuleg mögnun a notar aðeins 1 primer, veldisvísis mögnun b hefur 2 primera.

Línuleg RCA er einnig kallað single primer RCA.Grunnur binst hringlaga DNA og er framlengdur með virkni DNA pólýmerasa.Varan er línuleg einstrengs með miklum fjölda endurtekinna raða þúsundfaldri lengd einni lykkju.

Þar sem afurð línulegs RCA er alltaf tengd við upphafsgrunninn er auðveld festing merksins stór kostur.

Exponential RCA, einnig þekkt sem Hyper branched amplification HRCA (Hyper branched RCA), í veldisvísandi RCA, einn primer magnar upp RCA vöruna, annar primer blendar við RCA vöruna og nær, og skiptin er þegar bundin við RCA vöruna. Downstream primers lengja strenginn, og endurtaka framlengingu og skipti til að framleiða dendritic vöru.

Kostir og gallar kjarnsýrumögnunar í rúllandi hring

Kostir RCA:

Mikið næmi, góð sértækni og auðveld notkun.

Gallar á RCA:

Bakgrunnsvandamál við merkjagreiningu.Meðan á RCA-hvarfinu stendur geta óhringlausi hengilásrannsakan og sniðmáts-DNA eða RNA óbundins rannsakanda myndað einhver bakgrunnsmerki. 

Nmögnun sem byggir á ucleiccid röð

Kjarnsýruraðbundin mögnun (NASBA) er ný tækni þróuð á grundvelli PCR.Um er að ræða samfellda og jafnhita kjarnsýrumögnun sem stýrt er af pari af primerum með T7 promoter röð.Tæknin getur magnað sniðmát RNA um það bil 109 sinnum á um það bil 2 klukkustundum, sem er 1000 sinnum hærra en hefðbundin PCR aðferð og krefst ekki sérstaks búnaðar.

Þessi tækni hefur verið notuð til að greina sjúkdóma hratt um leið og hún birtist og mörg fyrirtæki nota þessa aðferð í RNA-greiningarsettum um þessar mundir.

Þrátt fyrir að RNA mögnun geti einnig notað PCR tækni um öfuga umritun, hefur NASBA sína eigin kosti: það er hægt að framkvæma við tiltölulega stöðugt hitastig og það er stöðugra og nákvæmara en hefðbundin PCR tækni.

Hvarfið er við 41 gráður á Celsíus og þarf AMV (avian myeloblastosis virus) bakrit, RNase H, T7 RNA pólýmerasa og par af primerum til að klára.

Ferlið felur aðallega í sér:

Framvirki primerinn inniheldur viðbótarröð T7-hvatarans.Við hvarfið binst framvirki grunnurinn RNA strengnum og er hvataður af AMV ensíminu til að mynda DNA-RNA tvíþráð.

RNase H meltir RNA í blendingum tvístrengsins og heldur einþátta DNA.

Undir virkni öfugs primersins og AMV ensímsins myndast DNA tvíþráður sem inniheldur T7 promoter röðina.

Undir verkun T7 RNA pólýmerasa er umritunarferlinu lokið og mikið magn af mark-RNA er framleitt.

Kostir NASBA:

(1) Grunnur þess er með T7-stýringarröð, en erlenda tvíþátta DNA-efnið hefur enga T7-stuðlaröð og er ekki hægt að magna það, þannig að þessi tækni hefur mikla sértækni og næmni.

(2) NASBA fellur beint öfuga umritunarferlið inn í mögnunarviðbrögðin, sem styttir viðbragðstímann.

Ókostir NASBA:

(1) Viðbragðsþættirnir eru flóknari.

(2) Þrjár tegundir af ensímum eru nauðsynlegar til að gera viðbragðskostnaðinn hærri.