Rauntíma PCR, einnig þekkt sem magn PCR eða qPCR, er aðferð til að fylgjast með og greina í rauntíma PCR mögnunarafurðum.
Vegna þess að megindleg PCR hefur kosti einfaldrar notkunar, hraðvirkrar og þægilegrar notkunar, mikillar næmni, góðrar endurtekningarhæfni og lágs mengunarhraða, er það mikið notað í læknisfræðilegum prófunum, mat á lyfjavirkni, rannsóknum á genatjáningu, erfðafræðilegum rannsóknum, genagreiningu, sjúkdómsgreiningu, dýra- og plantnagreiningu., matarprófanir og önnur svið.
Þess vegna, hvort sem þú stundar grunnrannsóknir í lífvísindum, eða starfsmenn lyfjafyrirtækja, búfjárræktarfyrirtækja, matvælafyrirtækja, eða jafnvel starfsmenn inngöngu-útgönguskoðunar og sóttkvístofnana, umhverfiseftirlitsdeilda, sjúkrahúsa og annarra eininga, verður þú meira og minna fyrir áhrifum af Eða þú þarft að þekkja þekkingu á að ná tökum á magnbundinni PCR.

Meginregla rauntíma PCR

Rauntíma PCR er aðferð þar sem flúrljómandi efnum er bætt við PCR hvarfkerfið og fylgst er með styrk flúrljómunarmerkja í ferli PCR hvarfsins í rauntíma með magnbundnu PCR tæki og að lokum eru tilraunagögn greind og unnin.

【Mögnunarferill】er ferillinn sem lýsir kraftmiklu ferli PCR.Mögnunarferill PCR er í raun ekki venjulegur veldisvísisferill heldur sigmóíðferill.

[Pallfasi mögnunarferils]Með aukningu á fjölda PCR hringrása, óvirkjun á DNA pólýmerasa, eyðingu dNTPs og primers, og hömlun á nýmyndunarviðbrögðum með efnahvarfinu pýrófosfati o.s.frv., stækkar PCR ekki alltaf veldisvísis., og mun að lokum fara inn á hásléttu.

[veldisvaxtarsvæði mögnunarferils]Þótt hálendisfasinn sé mjög mismunandi, á ákveðnu svæði veldisvaxtarsvæðis mögnunarferilsins, er endurtekningarnákvæmni mjög góð, sem er mjög mikilvægt fyrir megindlega greiningu á PCR.

[Þröskuldsgildi og Ct gildi]Við setjum viðmiðunarmörk flúrljómunargreiningar á viðeigandi stað á veldisvaxtarsvæði mögnunarferilsins, þ.e. þröskuldsgildi (Threshold).Skurðpunktur þröskuldsgildis og mögnunarferils er Ct gildið, það er að segja Ct gildið vísar til fjölda lota (Threshold Cycle) þegar þröskuldsgildinu er náð.

Grafið hér að neðan sýnir greinilega sambandið milli þröskuldslínu og mögnunarferils, þröskulds og Ct gildis.

【Hvernig á að mæla?】

Það hefur verið sannað með stærðfræðikenningum að Ct gildið hefur öfugt línulegt samband við lógaritma fjölda upphafssniðmáta.Rauntíma PCR fylgist með PCR mögnunarvörum í rauntíma og mælir þær á veldismælingarfasa.

Fyrir hverja PCR lotu jókst DNA veldisvísis tvisvar sinnum og náði fljótlega hásléttu.

Að því gefnu að magn upphafs-DNA sé A₀ , eftir n lotur er hægt að gefa upp fræðilegt magn af DNA afurð sem:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Síðan, því meira sem upphafs-DNA magnið A 0 er, því fyrr nær magn magnaðrar afurðar greiningargildinu An og fjöldi lota þegar An er náð er Ct gildið.Það er, því meira sem upphafs DNA magnið A 0 er, því fyrr nær mögnunarferillinn hámarki og að sama skapi er nauðsynlegur fjöldi lota n minni.

Við framkvæmum hallaþynningu á staðlinum með þekktan styrk og notum hann sem sniðmát fyrir rauntíma PCR, og röð mögnunarferla verða fengnar með jöfnu millibili í röð upphafs DNA magns frá meira til minna.Samkvæmt línulegu sambandi milli Ct gildisins og logaritma fjölda upphafssniðmáta, aHægt er að búa til [staðlaðan feril] .

Með því að skipta Ct gildi sýnisins með óþekktum styrk inn í staðlaða ferilinn er hægt að fá upphaflega sniðmátsmagn sýnisins með óþekktan styrk, sem er meginregla rauntíma PCR.

Uppgötvunaraðferð rauntíma PCR

Rauntíma PCR greinir PCR mögnunarafurðir með því að greina flúrljómunarstyrkinn í hvarfkerfinu.

Meginregla flúrljómandi litarefnisins】

Flúrljómandi litarefni, eins og TB Green ® , getur ósértækt bundist tvíþátta DNA í PCR kerfum og flúrljómað við bindingu.

Flúrljómunarstyrkur í hvarfkerfinu jókst veldisvísis með aukningu á PCR lotum.Með því að greina flúrljómunarstyrkinn er hægt að fylgjast með magni DNA mögnunar í hvarfkerfinu í rauntíma og síðan er hægt að áætla magn upphafssniðmátsins í sýninu öfugt.

【Meginregla flúrljómandi rannsaka aðferð】

flúrljómandi rannsakaer kjarnsýruröð með flúrljómandi hóp í 5′ endanum og slökkvihóp í 3′ endanum, sem getur bundist sniðmátinu sérstaklega.Þegar rannsakandinn er ósnortinn er flúrljómunin sem flúorfór gefur frá sér slökkt af slökkvihópnum og getur ekki flúrljómað.Þegar rannsakann er niðurbrotinn mun flúrljómandi efnið sundrast og gefa frá sér flúrljómun.

Flúrljómandi rannsaka er bætt við PCR hvarflausnina.Á meðan á glæðingarferlinu stendur mun flúrljómandi rannsakandinn bindast sértækri stöðu sniðmátsins.Meðan á framlengingarferlinu stendur getur 5′→3′ exonuclease virkni PCR ensímsins brotið niður flúrljómandi rannsakann sem blandaður er við sniðmátið og flúrljómandi efnið er sundrað til að gefa frá sér flúrljómun.Með því að greina flúrljómunarstyrk rannsakans í hvarfkerfinu er hægt að ná þeim tilgangi að fylgjast með mögnunarmagni PCR vörunnar.

【Val á flúrljómunargreiningaraðferð】

Ef það er notað til að greina raðir með mikla samsvörun og framkvæma multiplex PCR uppgötvun eins og SNP vélritunargreiningu, er flúrljómandi rannsaka aðferðin óbætanlegur.
Fyrir aðrar rauntíma PCR tilraunir er hægt að nota einfalda, auðvelda og ódýra flúrljómandi chimera aðferð.

rannsaka Sterk sérhæfni, fær um multiplex PCR

Galli

Kröfur um mikla sérhæfni fyrir mögnun;

multiplex PCR er ekki hægt að framkvæma Þarftu að hanna sérstakar rannsaka, hár kostnaður;

stundum er rannsakandi hönnun erfið

Skyldar vörur: