Ct-gildi er mikilvægasta niðurstaða kynningarform flúrljómandi megindlegrar PCR.Það er notað til að reikna út mismun á genatjáningu eða fjölda genaafrita.Svo hvað er Ct gildi flúrljómunarmælingar talið sanngjarnt?Hvernig á að tryggja skilvirkt svið Ct gildi?
Hvað er Ct gildi?
Meðan á qPCR mögnunarferlinu stendur, samsvarar fjöldi mögnunarlota (Cycle Threshold) þegar flúrljómunarmerki mögnuðu vörunnar nær settum flúrljómunarþröskuldi.C stendur fyrir Cycle og T stendur fyrir Threshold.Einfaldlega sagt, Ct gildið er fjöldi lota sem samsvarar því þegar upphaflega sniðmátamögnunin nær ákveðnu magni af afurð í qPCR.Svokallað „ákveðið magn af vöru“ verður nánar útskýrt síðar.
Hvað gerir Ct gildið?
1.Samband á milli veldisvísis mögnunar, sniðmátsmagns og Ct gildi
Helst er genum í qPCR safnað með veldisvísis mögnun eftir ákveðinn fjölda lota.Sambandið á milli fjölda mögnunarlota og magns afurða er: Magnað magn afurðar = upphaflegt sniðmátsmagn × (1+En) lotunúmer.Hins vegar er qPCR viðbrögðin ekki alltaf í kjöraðstæðum.Þegar magn magnaðrar afurðar nær „ákveðnu vörumagni“ er fjöldi lota á þessum tíma Ct-gildið og það er á veldisvísismögnunartímabilinu.Sambandið milli Ct gildis og magns upphafssniðmáts: Það er línulegt samband á milli Ct gildis sniðmátsins og lógaritma upphafsnúmers sniðmátsins.Því hærra sem upphaflega sniðmátsstyrkurinn er, því minna er Ct gildið;því lægri sem upphaflega sniðmátsstyrkurinn er, því hærra er Ct gildið.
2.Mögnunarferill, flúrljómunarþröskuldur og ákveðið PCR vörumagn
Magn qPCR mögnunarafurðar er beint sett fram í formi flúrljómandi merkis, það er mögnunarferillinn.Á fyrstu stigum PCR er mögnunin við kjöraðstæður, fjöldi lota er lítill, vöruuppsöfnunin er lítil og ekki er hægt að greina skýrt magn flúrljómunar frá flúrljómunarbakgrunni.Eftir það eykst flúrljómunin og fer í veldisfasa.Magn PCR afurðar er hægt að greina á ákveðnum tímapunkti þegar PCR hvarfið er bara í veldisfasa, sem hægt er að nota sem „ákveðið magn af afurð“ og hægt er að ráða upphafsinnihald sniðmátsins af þessu.Þess vegna er styrkleiki flúrljómunarmerkja sem samsvarar ákveðnu magni af vöru flúrljómunarmörkin.
Á seint stigi PCR sýnir mögnunarferillinn ekki lengur veldisvísismögnun og fer í línulega fasa og hálendisfasa.
3.Reproducibility Ct gildi
Þegar PCR hringrásin nær hringrásarnúmeri Ct gildisins, er hún nýkomin inn í hið sanna veldisvísismögnunartímabil.Á þessum tíma hefur litla villan ekki verið mögnuð, þannig að endurgerð Ct gildisins er frábært, það er að sama sniðmátið er magnað á mismunandi tímum eða í mismunandi rörum á sama tíma.Mögnun, Ct gildið sem fæst er stöðugt.
1. Amplification skilvirkni En
PCR mögnunarhagkvæmni vísar til skilvirkninnar sem pólýmerasinn breytir geninu sem á að magna upp í amplicon.Mögnunarvirknin þegar einni DNA sameind er umbreytt í tvær DNA sameindir er 100%.Mögnunarvirkni er almennt gefin upp sem En.Til að auðvelda greiningu á síðari greinum eru þeir þættir sem hafa áhrif á mögnunarvirkni kynntir stuttlega.
| Áhrifaþættir | skýringu | Hvernig á að dæma? |
| A. PCR hemlar | 1. Sniðmát DNA inniheldur efni sem hindra PCR viðbrögð, eins og prótein eða hreinsiefni.2. cDNA eftir öfuga umritun inniheldur háan styrk af sniðmát RNA eða RT hvarfefnisþáttum, sem geta einnig hindrað síðari PCR viðbrögð. | 1. Hvort um mengun er að ræða má dæma með því að mæla hlutfallið A260/A280 og A260/A230 eða RNA rafskaut.2. Hvort cDNA er þynnt í samræmi við ákveðið hlutfall eftir öfuga umritun. |
| B. Óviðeigandi grunnhönnun | Grunnur glæður ekki á skilvirkan hátt | Athugaðu primer fyrir primer-dimers eða hárnælur, ósamræmi og stundum spannar innri hönnun. |
| C. Óviðeigandi hönnun PCR viðbragðsáætlunar | 1. Grunnur getur ekki hitnað á áhrifaríkan hátt2. Ófullnægjandi losun DNA pólýmerasa 3. Langtíma háhita DNA pólýmerasavirkni minnkaði | 1. Glerunarhitastigið er hærra en TM gildi grunnsins2. Tími fyrir afeitrun er of stuttur 3. Tími hvers stigs hvarfferlisins er of langur |
| D. Ófullnægjandi blöndun hvarfefna eða villur í pípulagningu | Í hvarfkerfinu er staðbundinn styrkur PCR hvarfþátta of hár eða ójafn, sem leiðir til mögnunar án veldisvísis á PCR mögnun | |
| E. Amplicon Lengd | Lengd magnara er of löng, fer yfir 300bp, og mögnunarnýtingin er lítil | Gakktu úr skugga um að lengd amplicons sé á milli 80-300bp |
| F. Áhrif qPCR hvarfefna | Styrkur DNA pólýmerasa í hvarfefninu er lágur eða styrkur jóna í jafnalausninni er ekki fínstilltur, sem leiðir til þess að Taq ensímvirkni nær ekki hámarki | Ákvörðun á mögnunarvirkni með stöðluðu ferli |
2.Range Ct gildi
Ct gildi eru á bilinu 15-35.Ef Ct gildið er minna en 15 er talið að mögnunin sé innan marka grunnlínutímabilsins og flúrljómunarmörkum hafi ekki verið náð.Helst er línulegt samband á milli Ct gildisins og logaritma upphafsnúmers afrits sniðmátsins, það er staðalferilsins.Í gegnum staðlaða ferilinn, þegar mögnunarvirknin er 100%, er reiknað Ct-gildi til að mæla eintaksfjölda gensins um 35. Ef það er meira en 35 er upphafsfjöldi sniðmátsins fræðilega minna en 1, sem getur talist tilgangslaust.
Fyrir mismunandi Ct svið gena, vegna mismunar á fjölda genaafrita og mögnunarvirkni í upphaflegu sniðmátimagni, er nauðsynlegt að gera staðlaða feril fyrir genið og reikna út línulegt greiningarsvið gensins.
3.Áhrifaþættir Ct gildi
Af sambandinu milli fjölda mögnunarlota og magns afurðar: magn magnaðrar afurðar = magn upphafssniðmáts × (1+En) lotunúmer, má sjá að við kjöraðstæður hefur magn upphafssniðmáts og En neikvæð áhrif á Ct gildi.Munurinn á gæðum sniðmáts eða mögnunarvirkni mun valda því að Ct gildið verður of stórt eða of lítið.
4.Ct gildi er of stórt eða of lítið
Birtingartími: 22-2-2023
