Sameindagreiningartækni notar sameindalíffræðiaðferðir til að greina tjáningu og uppbyggingu erfðaefnis mannslíkamans og ýmissa sýkla til að ná þeim tilgangi að spá fyrir um og greina sjúkdóma.

Á undanförnum árum, með uppfærslu og endurtekningu á sameindagreiningartækni, hefur klínísk beiting sameindagreiningar orðið sífellt umfangsmeiri og ítarlegri og sameindagreiningarmarkaðurinn hefur gengið inn í hraða þróun.

Höfundur tekur saman algenga sameindagreiningartækni á markaðnum og skiptist í þrjá hluta: Fyrsti hlutinn kynnir PCR tæknina, seinni hlutinn kynnir kjarnsýrujafnhita mögnunartæknina og seinni hlutinn kynnir raðgreiningartæknina.

01

Hluti I: PCR tækni

PCR tækni

PCR (pólýmerasa keðjuverkun) er ein af in vitro DNA mögnunartækni, með sögu um meira en 30 ár.

PCR tækni var frumkvöðull árið 1983 af Kary Mullis frá Cetus, Bandaríkjunum.Mullis sótti um PCR einkaleyfi árið 1985 og gaf út fyrstu PCR fræðilegu ritgerðina um vísindi sama ár.Mullis hlaut Nóbelsverðlaunin í efnafræði árið 1993.

Grunnreglur PCR

PCR getur magnað mark DNA brot um meira en eina milljón sinnum.Meginreglan er sú að undir hvata DNA pólýmerasa er móðurstrengurinn DNA notaður sem sniðmát og sérstakur grunnur er notaður sem upphafspunktur fyrir framlengingu.Það er endurtekið in vitro með skrefum eins og eðlisbreytingu, glæðingu og framlengingu.Ferlið dótturstrengs DNA sem er viðbót við móðurstrengssniðmát DNA.

Hið staðlaða PCR ferli er skipt í þrjú skref:

1. Denaturation: Notaðu háan hita til að aðskilja DNA tvíþræði.Vetnistengin milli DNA tvíþráða rofna við háan hita (93-98°C).

2. Glæðing: Eftir að tvíþátta DNA er aðskilið er hitastigið lækkað þannig að grunnurinn geti bundist einþátta DNA.

3. Framlenging: DNA pólýmerasinn byrjar að búa til viðbótarþræði meðfram DNA þráðunum úr primerunum sem eru bundnir þegar hitastigið er lækkað.Þegar framlengingunni er lokið er hringrás lokið og fjöldi DNA-búta tvöfaldast.

Með því að endurtaka þessi þrjú skref 25-35 sinnum mun fjöldi DNA búta aukast veldisvísis.

Snilldin við PCR er að hægt er að hanna mismunandi primera fyrir mismunandi markgen, þannig að hægt sé að magna upp markgenbrotin á stuttum tíma.

Hingað til er hægt að skipta PCR í þrjá flokka, nefnilega venjulegt PCR, flúrljómandi magn PCR og stafrænt PCR.

Fyrsta kynslóð venjulegs PCR

Notaðu venjulegt PCR mögnunartæki til að magna upp markgenið og notaðu síðan agarósa gel rafdrætti til að greina vöruna, aðeins er hægt að gera eigindlega greiningu.

Helstu ókostir fyrstu kynslóðar PCR:

-Hæjast við ósértæka mögnun og rangar jákvæðar niðurstöður.

-Greiningin tekur langan tíma og aðgerðin er fyrirferðarmikil.

-Aðeins er hægt að gera eigindlegar prófanir.

Önnur kynslóð flúrljómunar magn PCR

Fluorescence quantitative PCR (Real-Time PCR), einnig þekktur sem qPCR, er notað til að fylgjast með uppsöfnun magnaðra afurða með uppsöfnun flúrljómunarmerkja með því að bæta við flúrljómunarkönnunum sem geta gefið til kynna framvindu hvarfkerfisins, og til að dæma niðurstöðurnar í gegnum flúrljómunarferilinn, og það er hægt að mæla það með stöðluðu gildi og staðalferli.

Vegna þess að qPCR tæknin er framkvæmd í lokuðu kerfi minnka líkurnar á mengun og hægt er að fylgjast með flúrljómunarmerkinu fyrir magngreiningu, þannig að það er mest notað í klínískri framkvæmd og hefur orðið ríkjandi tækni í PCR.

Hægt er að skipta flúrljómandi efnum sem notuð eru í rauntíma flúrljómandi magni PCR í: TaqMan flúrljómun, sameindavita og flúrljómandi litarefni.

1) TaqMan flúrljómandi rannsaka:

Meðan á PCR mögnun stendur er sérstökum flúrljómandi rannsakanda bætt við á meðan pari af primerum er bætt við.Nefndin er fákirni og endarnir tveir eru merktir með reporter flúrljómandi hóp og quencher flúrljómandi hóp.

Þegar rannsakandinn er ósnortinn, frásogast flúrljómandi merkið sem blaðamannahópurinn gefur frá sér af slökkvihópnum;meðan á PCR mögnun stendur, klýfur 5′-3′ exonuclease virkni Taq ensímsins og rýfur rannsakann, sem gerir reporter flúrljómandi hópinn og deyfingu. cence merki er algjörlega samstillt við myndun PCR vörunnar.

2) SYBR flúrljómandi litarefni:

Í PCR hvarfkerfinu er ofgnótt af SYBR flúrljómandi litarefni bætt við.Eftir að SYBR flúrljómandi liturinn er ósértækur felldur inn í DNA tvístrenginn gefur það frá sér flúrljómandi merki.SYBR litarefni sameindarinnar sem er ekki felld inn í keðjuna mun ekki gefa frá sér nein flúrljómandi merki og tryggir þar með flúrljómunarmerkið. Aukningin á PCR vörum er algjörlega samstillt við aukningu á PCR vörum.SYBR binst aðeins tvíþátta DNA og því er hægt að nota bræðsluferilinn til að ákvarða hvort PCR viðbrögðin séu sértæk.

3) Sameindavitar

Það er stofnlykkja tvímerkt fákjarnanemi sem myndar hárnálabyggingu sem er um það bil 8 basar við 5 og 3 endana.Kjarnsýruraðirnar í báðum endum eru pöruð saman, sem veldur því að flúrljómandi hópurinn og slökkvihópurinn eru þéttir.Lokið, það mun ekki framleiða flúrljómun.

Eftir að PCR afurðin er mynduð, á meðan á glæðingarferlinu stendur, er miðhluti sameindavitans paraður við ákveðna DNA röð og flúrljómandi genið er aðskilið frá quencher geninu til að framleiða flúrljómun.

Helstu ókostir annarrar kynslóðar PCR:

Næmni er enn ábótavant og uppgötvun lítilla eintaka er ekki nákvæmur.

Það eru áhrif á bakgrunnsgildi og niðurstaðan er næm fyrir truflunum.

Þriðja kynslóð stafræns PCR

Stafræn PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) reiknar út afritsnúmer markröðarinnar með endapunktagreiningu og getur framkvæmt nákvæma algera magngreiningu án þess að nota innra eftirlit og staðlaða ferla.

Stafræn PCR notar endapunktagreiningu og er ekki háð Ct gildi (hringrásarþröskuldi), þannig að stafræn PCR viðbrögð verða fyrir minni áhrifum af mögnunarvirkni og þol fyrir PCR viðbragðshemlum er bætt, með mikilli nákvæmni og endurgerðanleika.

Vegna eiginleika mikillar næmni og mikillar nákvæmni er það ekki auðveldlega truflað af PCR viðbragðshemlum og það getur náð raunverulegri algerri magngreiningu án staðlaðra vara, sem hefur orðið rannsóknar- og notkunarsvæði.

Samkvæmt mismunandi gerðum hvarfeiningarinnar er hægt að skipta henni í þrjár gerðir: örvökvakerfi, flísakerfi og dropakerfi.