Bein PCR er hvarf sem notar dýra- eða plöntuvef beint til mögnunar án kjarnsýruútdráttar.Á margan hátt virkar bein PCR eins og venjulegur PCR

Helsti munurinn er sérsniðinn stuðpúði sem notaður er í beinni PCR, sýnið má fara beint í PCR hvarfið án kjarnsýruútdráttar, en samsvarandi kröfur eru gerðar um þol ensíma og samhæfni jafnalausnar sem tekur þátt í beinu PCR hvarfinu.

Þó að það séu meira og minna PCR hemlar í algengum sýnum, getur bein PCR samt náð áreiðanlegri mögnun undir virkni ensíma og jafna.Hefðbundin PCR viðbrögð krefjast hágæða kjarnsýru sem sniðmát, sem getur hindrað hnökralausa framvindu PCR viðbragða ef sniðmátið inniheldur prótein og önnur óhreinindi.Bein PCR er eins og er ein vinsælasta tæknin á sviði sameindagreiningar.

01 Direct PCR var upphaflega notað fyrir dýr og plöntur

Fyrsta beiting beins PCR er á sviði dýra og plantna, svo sem blóðs, vefja og hárs á rottum, köttum, kjúklingum, kanínum, sauðfé, nautgripum o.s.frv., plöntublöð og fræ o.

Þessi svið hafa nokkra sameiginlega eiginleika, það er að innihald markgenanna er tiltölulega hátt og kjarnsýruútdráttur er erfiður, þannig að bein PCR getur ekki aðeins sparað tíma og haft lítil áhrif á niðurstöðurnar heldur einnig sparað kostnað.

Bein PCR notað til að greina sýkla er spurning undanfarin ár, sumir PCR hvarfefnisframleiðendur hafa lagt mikið á sig í þessa átt við nýsköpun.Sérstaklega í þessum COVID-19 faraldri hafa margar slíkar uppgötvunarvörur birst á markaðnum, svo sem SARS-CoV-2 kjarnasýrugreiningarsett (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method) rannsakað og þróað af Foregene, sem notar rauntíma RT PCR tækni (rRT-PCR) til eigindlegrar uppgötvunar á SARS-Coopharynal sýni í mönnum eða sýkingu í mönnum. s.

Foregene er eitt þeirra fyrirtækja sem nota Direct PCR tækni til að greina eðlilegt ORF1ab, N, E ogafbrigði kjarnsýrur í nefkoki eða munnkoki úr mönnum eins og SARS-CoV-2 B.1.1.7 ætt (UK), B.1.351 ætt (ZA), B.1.617 ætt (IND) og P.1 ætt (BR).

02  Hvarfefni sem þarf fyrir beina PCR

Sýna lýsat

Sýnislýsatið er hægt að stilla sjálfur eða kaupa.Munurinn á samsetningu mismunandi tegunda lýsats mun gera leysingargetuna öðruvísi og þá verður leysingartíminn aðeins öðruvísi.Til dæmis, til að undirbúa vefjasýni úr dýrum, er almennt mælt með 30 mínútum eða yfir nótt lýsi og lýsislausn fyrir veirur er á bilinu 3-10 mínútur.

PCR master blanda

Mælt er með því að nota hot-start DNA pólýmerasa til að auka sérstaka mögnun og auka mögnunargetu.Kjarni beins PCR er mjög þolinn pólýmerasi.

Fjarlægðu eða hindraðu efni í sýninu sem hafa áhrif á DNA mögnun

Eftir að sýnið hefur verið unnið með lýsatinu, losna prótein, lípíð og önnur frumurusl, þessi efni hindra PCR viðbrögðin.Þess vegna þarf bein PCR að bæta við samsvarandi fjarlægingu eða hemlum til að draga úr áhrifum þessara þátta.

03  Safn fimm þekkingarpunkta um beina PCR

Í fyrsta lagi er bein PCR tækni bein PCR tækni fyrir ýmis lífsýni.Við þetta tæknilega ástand er engin þörf á að aðskilja og draga út kjarnsýruna, nota vefjasýnishornið beint sem hlut og bæta við markgena frumurunum sem eiga að framkvæma PCR viðbrögðin.

Í öðru lagi er bein PCR tækni ekki aðeins hefðbundin DNA sniðmát mögnunartækni, heldur felur hún einnig í sér RNA sniðmát öfug umritun PCR.

Í þriðja lagi framkvæmir Direct PCR tæknin ekki aðeins beinlínis venjubundin eigindleg PCR viðbrögð á vefjasýnum, heldur felur hún einnig í sér rauntíma qPCR viðbrögð, sem krefst þess að hvarfkerfið hafi sterka getu gegn bakgrunni flúrljómunartruflana og innræn flúrljómun slökknar á mótefnahæfni.

Í fjórða lagi þurfa sýnin sem Direct PCR tæknin miðar að aðeins að losa kjarnsýrusniðmát og fjarlægja ekki prótein, fjölsykrur, saltjónir osfrv. sem trufla PCR viðbrögðin.Sem krefst þess að kjarnsýrupólýmerasa og PCR Mix í hvarfkerfinu hafi framúrskarandi mótstöðu og aðlögunarhæfni til að tryggja ensímvirkni og afritunarnákvæmni við flóknar aðstæður.

Í fimmta lagi er vefjasýnið sem beint er PCR tækni sem miðar að án kjarnsýruauðgunarmeðferðar og magn sniðmáts er mjög lítið, sem krefst þess að hvarfkerfið hafi mjög mikla næmni og mögnunarvirkni.