Ég tel að allir muni alltaf lenda í slíkum eða slíkum vandamálum þegar þeir gera PCR viðbrögð, en flest þeirra má flokka í tvö megin vandamál:

Of lítil mögnun á genasniðmátinu (mögnun);
Of mikil genamögnun utan markhóps.
Notkun aukefna er ein af algengustu aðferðunum til að leysa þessi vandamál.Venjulega hefur hlutverk aukefna tvær hliðar:
efri uppbygginguaf genum (efri byggingu);
Draga úr ósértækri grunnun.
Í dag mun ritstjórinn kynna þér stuttlega algeng aukefni í PCR viðbrögðum og virkni þeirra.
Aukefni sem draga úr aukabyggingu
súlfoxíð(DMSO)
genasýnimeð hátt GC innihald.Hins vegar dregur DMSO einnig mjög úr Taq pólýmerasavirkni.Þess vegna verða allir að halda jafnvægi á aðgengi sniðmátsins og virkni pólýmerasans.Ritstjórinn leggur til að þú getir prófað mismunandi styrkleika DSMO, eins og frá 2% til 10%, til að finna styrkinn sem hentar tilrauninni þinni.
Ójónandi hreinsiefni
Ójónísk hreinsiefni, eins og 0,1-1% Triton X-100, Tween 20 eða NP-40, draga venjulega úr aukabyggingu DNA.Þó að þetta geti aukið mögnun sniðmátsgensins mun það einnig valda vandræðum með ósértæka mögnun.Svo, þessi aukefni virka vel fyrir PCR viðbrögð með lágum ávöxtun án russ, en ekki svo vel fyrir tiltölulega óhrein PRC viðbrögð.Annar ávinningur af ójónuðum hreinsiefnum er að draga úr SDS mengun.Venjulega á meðan á DNA útdráttarferlinu stendur verður SDS komið í PCR skrefið, sem hamlar mjög virkni pólýmerasans.Þess vegna getur það að bæta 0,5% Tween-20 eða Tween-40 við hvarfið óvirkt neikvæð áhrif SDS.
Betaine_
Betaín getur bætt DNA mögnun með því að draga úr myndun efri byggingu og er almennt „leyndardómur“ viðbót við PCR sett í atvinnuskyni.Ef þú vilt nota betaín, ættir þú að setja betaín eða betaín mónóhýdrat (Betain eða betaín mónóhýdrat), en ekki betaín hýdróklóríð (Betain HCl), stilla að lokastyrk 1-1,7M.Betaine getur einnig hjálpað til við að bæta sérhæfni vegna þess að það útilokar basaparsamsetningu háð DNA bráðnun/DNA eðlisbreytingu.
Aukefni til að draga úr ósértækri grunnun
Formamíð
Formamíð er algengt lífrænt PCR aukefni.Það getur sameinast meiriháttar og minni gróp í DNA, þar með dregið úr stöðugleika master DNA tvöfalda helix og lækkað bræðsluhita DNA.Styrkur formamíðs sem notaður er í PCR tilraunum er venjulega 1%-5%.
Tetrametýlammoníumklóríð( TMAC)
Tetrametýlammoníumklóríð getur aukið sérhæfni blendingar (blendingarsérhæfni) og aukið bræðsluhitastig DNA.Þannig getur TMAC fjarlægt ósértæka frumun og dregið úr misbindingu DNA og RNA.Ef þú notarúrkynjaðir primersí PCR hvarfinu, mundu að bæta við TMAC, sem er almennt notað í styrkleikanum 15-100mM.
Önnur algeng aukefni
Til viðbótar við tvo flokka aukefna sem nefndir eru hér að ofan, eru mörg algeng aukefni í PCR viðbrögðum, þó þau hafi mismunandi virkni, eru þau einnig mjög mikilvæg.
Magnesíumjón
Magnesíumjón er ómissandi cofactor (cofactor) pólýmerasa, það er að segja án magnesíumjónar er pólýmerasi óvirkur.Hins vegar getur of mikið magnesíumjónir einnig haft áhrif á skilvirkni pólýmerasans.Styrkur magnesíumjóna í hverju PCR-hvarfi er breytilegur.Klóbindandi efni (eins og EDTA eða sítrat), styrkur dNTP og próteina hafa öll áhrif á styrk magnesíumjóna.Þannig að ef þú átt í vandræðum með PCR tilraunina þína geturðu reynt að breyta mismunandi magnesíumjónastyrk, til dæmis úr 1,0 í 4,0mM, með 0,5–1mM bili á milli.
Það er athyglisvert að margar frystingar-þíðingarlotur geta leitt til styrkleika lagskiptingar magnesíumklóríðlausnarinnar.Þess vegna verður þú að leysa það alveg upp fyrir hverja notkun og blanda því vel saman áður en þú notar það.
Nautgripasermi albúmín(Bovine albúmín, BSA)
Í sameindaefnafræðitilraunum er albúmín í sermi nautgripa mjög algengt aukefni, sérstaklega í skerðingarensímmeltingu og PCR tilraunum.Í PCR viðbrögðum er BSA gagnlegt við að draga úr mengunarefnum eins og fenólsamböndum.Og það er líka sagt að það geti dregið úr viðloðun hvarfefna við vegg tilraunaglassins.Í PCR viðbrögðum getur styrkur BSA sem bætt er við venjulega náð 0,8 mg/ml.
 
Skyldar vörur:
PCR hetja(með litarefni)
PCR hetja