Að sannreyna frammistöðu grunna og rannsaka á fyrstu stigum PCR hvarfefna og ákvarða heppilegustu hvarfskilyrðin eru forsendur þess að tryggja hnökralaust framvindu formlegra tilrauna.
Svo hvernig þurfum við að staðfesta grunnrannsóknina á frumstigi?
Helstu vísbendingar eru grunnlína, mögnunarferill, ct-gildi, mögnunarvirkni, sýnisgreining með lágum styrk, CV o.s.frv.
Grunnlína
Grunnlínan er lárétt lína í PCR mögnunarferlinum.Í fyrstu lotum PCR mögnunarviðbragðsins breytist flúrljómunarmerkið ekki mikið og myndar beina línu.Þessi beina lína er grunnlínan.
Þegar skimað er PCR primer rannsaka skal fylgjast með því hvort grunnlínan sé jöfn.Hreinleiki grunnlínunnar mun hafa áhrif á grunnlínuna, eins og að valda því að grunnlínan hækkar eða lækkar.Grunnlínan er líka mjög leiðandi vísir.
Mögnunarferill
Annar leiðandi vísir er lögun mögnunarferilsins.Best er að hafa S-laga feril til að forðast aukamögnun eða aðrar óeðlilegar mögnunarferlar.
Ct gildi
Fjöldi lota sem samsvarar beygingarpunkti frá grunnlínu til veldisvaxtar er Ct gildið.
Fyrir sama sýni leiða mismunandi grunnrannsóknir til mismunandi mögnunarferla og samsvarandi Ct gildi verður fyrir áhrifum af mögnunarvirkni og truflunarstigi.Fræðilega séð, því minna sem Ct-gildið er í grunnrannsókninni sem við veljum, því betra.
Magnunarvirkni
Ein áreiðanlegasta og stöðugasta aðferðin til að meta skilvirkni PCR mögnunar er staðalferillinn, sem einnig er almennt viðurkenndur af vísindamönnum.Aðferðin felur í sér að búa til röð sýna til að stjórna hlutfallslegum fjölda marksniðmáta.Þessi sýni eru venjulega gerð með raðþynningum af óblandaðri stofnlausnum, sú sem oftast er notuð er 10-falda þynning.Notaðu röð þynntra sýna, með því að nota staðlað qPCR forrit til að magna til að fá Cq gildið og að lokum teikna staðalferil í samræmi við styrk hvers sýnis og samsvarandi Cq gildi til að fá línulegu jöfnuna Cq= -klgX0+b, og mögnunarvirkni E=10(-1 /k)-1.Þegar qPCR er notað fyrir megindlega greiningu þarf að mögnunarvirknin sé á bilinu 90%-110% (3,6>k>3,1).
Uppgötvun sýnis með lágum styrk
Þegar sýnisstyrkurinn er lágur er greiningarhraði mismunandi grunnrannsókna mismunandi.Við veljum 20 sýni með lágstyrk til að endurtaka og grunnrannsóknarkerfið með hæsta greiningarhraða er best.
Breytileikastuðull (CV)
Hægt er að greina 10 tvítekin sýni með mismunandi grunnrannsóknum í samræmi við línustaðal hvarfefnisins fyrir greiningu á kjarnsýrumögnun.
Magn hvarfefni:
Nákvæmni
Nákvæmnin innan einnar lotu ætti að uppfylla: breytileikastuðullinn (CV,%) lógaritmísks gildis prófunarstyrksins er ≤5%.Þegar sýnisstyrkurinn er lágur er breytileikastuðullinn (CV,%) logaritma greiningarstyrksins ≤10%
Eigindleg hvarfefni:
Nákvæmni
Nákvæmnin innan einnar lotu ætti að uppfylla:
(1) Fráviksstuðull Ct gildis (CV,%) ≤5%
Sama sýni er prófað samhliða 10 sinnum og niðurstöður úr prófunum ættu að vera í samræmi
Birtingartími: 18. september 2021
