Á fyrstu stigum faraldursins, vegna örrar þróunar, er hröð greining grunaðra sjúklinga lykillinn að því að koma í veg fyrir COVID-19.Sum viðurkennd kjarnsýrugreiningarhvarfefni hafa stuttan þróunartíma og það eru vandamál eins og flýti staðfesting á frammistöðu, ófullnægjandi fínstillingu hvarfefna og mikill munur á lotum;Vandamál ýmissa klínískra rannsóknarstofa í ýmsum þáttum kjarnsýrugreiningarferlisins geta einnig haft áhrif á nákvæmni kjarnsýrugreiningarniðurstaðna.Þessi grein mun einbeita sér að helstu hlekkjum og punktum í núverandi SARS-CoV-2 kjarnsýruuppgötvun og greina vandamálin við falska neikvæða og jákvæða endurskoðun á kjarnsýrugreiningu á rannsóknarstofu og klínískt ósamræmi.

Meginreglur um greiningu á SARS-CoV-2 kjarnsýrum

SARS-CoV-2 er RNA veira með erfðamengi sem er um 29 kb, með 10 genum, sem geta í raun umritað 10 prótein.Veirur eru samsettar úr RNA og próteini og ysta lagið er ytra lag sem samanstendur af lípíðum og glýkópróteinum.Að innan umlykur próteinkapslið RNA-efnið inn í það og verndar þar með auðbrjótanlegt RNA (P1).

P1 Uppbygging SARS-COV-2

Veirur ráðast inn í frumur í gegnum sérstaka frumuyfirborðsviðtaka til að valda sýkingu og nota hýsilfrumur til að fjölga sér.

Meginreglan um uppgötvun veirukjarnsýru er að afhjúpa veiru-RNA í gegnum frumulýsi og nota síðan rauntíma flúrljómandi öfug umritun-pólýmerasa keðjuverkun (RT-PCR) til að greina.

Lykillinn að greiningarreglunni er að nota primera og rannsaka til að ná „markvissri samsvörun“ á kjarnsýruröð, það er að finna kjarnsýruröð SARS-CoV-2 sem er frábrugðin öðrum vírusum í um það bil 30.000 bösum (líkt kjarnsýru og öðrum vírusum) „Lágt“ svæði), hanna primera og rannsaka.

Grunnarnir og rannsakanarnir eru mjög samsvörun við hið sérstaka svæði SARS-CoV-2 kjarnsýra, það er, sérhæfingin er mjög sterk.Þegar rauntíma flúrljómandi RT-PCR mögnunarniðurstaða sýnisins sem á að prófa er jákvæð, sannar það að SARS-CoV-2 er til staðar í sýninu.Sjá P2.

P2 skref SARS-CoV-2 kjarnsýruákvörðunar (rauntíma flúrljómandi RT-PCR)

Skilyrði og kröfur rannsóknarstofu fyrir SARS-CoV-2 kjarnsýrugreiningu

Kjarnsýruprófunarstofur eru tilvalinstar fyrir umhverfi með neikvæðum þrýstingi og þær ættu að huga að þrýstingsvöktun, halda lofti flæði og útrýma úðabrúsum.Kjarnsýruprófunarstarfsmenn verða að hafa samsvarandi menntun, hljóta viðeigandi pólýmerasa keðjuverkunarþjálfun og standast matið.Rannsóknarstofunni ætti að vera stranglega stjórnað, svæðisbundið á sínum stað og óviðkomandi starfsfólki er stranglega bannað að koma inn.Hreint svæðið ætti að vera loftræst og sótthreinsað á sínum stað.Viðeigandi hlutir eru settir á svæði, hreinir og óhreinir eru aðskildir, skipt út á réttum tíma og afmengað á sínum stað.Venjuleg sótthreinsun: Sótthreinsiefni sem inniheldur klór er aðallausnin fyrir stærri svæði og 75% áfengi má nota fyrir lítil svæði.Góð leið til að takast á við úðabrúsa er að opna glugga fyrir loftræstingu og loftsótthreinsun er einnig hægt að framkvæma með útfjólubláum geislum, síun og loftsótthreinsun.

Lykiltenglar og breytur við SARS-CoV-2 kjarnsýruákvörðun (rauntíma flúrljómandi RT-PCR)

Þrátt fyrir að rannsóknarstofur fylgist almennt vel með kjarnsýru „uppgötvun“ er í raun „útdráttur“ kjarnsýra einnig eitt af lykilskrefunum fyrir árangursríka uppgötvun, sem er nátengt söfnun og geymslu vírussýna.

Sem stendur notast við mest notuðu öndunarfærasýnin, eins og nefkoksþurrkur, seinni aðferðina, sem er óvirkjunar- (varðveislu) lausn sem er útbúin á grundvelli kjarnsýruútdráttar og lýsislausnar.Annars vegar getur þessi vírusvörnunarlausn denaturað prótein veirunnar, tapað virkni sinni og ekki lengur verið smitandi og bætt öryggi flutnings- og uppgötvunarstigsins;á hinn bóginn getur það beint sprungið vírusinn til að losa kjarnsýruna, útrýma kjarnsýruniðurbrotsensíminu og koma í veg fyrir vírusinn.RNA er brotið niður.

Veirusýnatökulausn sem er útbúin á grundvelli kjarnsýruútdráttar lýsislausnar.Helstu innihaldsefnin eru jafnvægissölt, etýlendíamíntetraediksýra klóbindiefni, gúanidínsalt (gúanidínísóþíósýanat, gúanidínhýdróklóríð osfrv.), anjónísk yfirborðsvirk efni (dódekan) natríumsúlfat), katjónísk yfirborðsvirk efni (tetradecýltrímetýlammóníumoxalat), dítótíhýdroxínól, 8-hýdroxýnól og fleiri próteinþættir, K.Sem stendur eru til margar tegundir af kjarnsýruútdráttarsettum og mismunandi kjarnsýruútdráttar- og hreinsunarhvarfefni eru notuð.Jafnvel þótt sama kjarnsýruútdráttar- og hreinsunarhvarfefnið sé notað, eru útdráttaraðferðir hvers setts mismunandi.

Sem stendur eru kjarnsýrugreiningarsett vörurnar sem samþykktar eru af National Medical Products Administration valdar út frá ORF1ab, E og N genum í SARS-CoV-2 erfðamengi.Uppgötvunarreglur mismunandi vara eru í grundvallaratriðum þær sömu, en grunnur þeirra og rannsaka er mismunandi.Það eru einmarkshlutar (ORF1ab), tvímarkshlutar (ORF1ab, N eða E) og þrímarkshlutar (ORF1ab, N og E).Munurinn á greiningu og túlkun, kjarnsýruútdrætti og rauntíma flúrljómandi RT-PCR hvarfkerfi ætti að vísa til viðeigandi leiðbeininga setts og mælt er með því að notendur fylgi nákvæmlega túlkunaraðferðinni sem tilgreind er í leiðbeiningunum um túlkun.Sameiginlegu svæðin, frumur og rannsakaraðir sem magnaðar eru upp með rauntíma flúrljómandi RT-PCR eru sýndar í P3.

P3 Staðsetning SARS-CoV-2 amplicon marksins á erfðamenginu og röð frumra og rannsaka

Túlkun á niðurstöðum SARS-CoV-2 kjarnsýruákvörðunar (Real-Time flúrljómandi RT-PCR)

„Áætlun um forvarnir og eftirlit með lungnabólgu vegna SARS-CoV-2 sýkingar (Önnur útgáfa)“ skýrði í fyrsta skipti viðmiðin til að dæma niðurstöður stökum gena mögnun:

1. Ekkert Ct eða Ct≥40 er neikvætt;

2. Ct<37 er jákvætt;

3. Ct gildið 37-40 er gráskalasvæðið.Mælt er með því að endurtaka tilraunina.Ef niðurstaðan af endurgerð Ct<40 og mögnunarferillinn hefur augljósa toppa er sýnið metið sem jákvætt, annars er það neikvætt.“

Þriðja útgáfa leiðarvísisins og fjórða útgáfa handbókarinnar héldu ofangreindum viðmiðum áfram.Hins vegar, vegna mismunandi skotmarka sem notuð eru í viðskiptasettum, gaf fyrrnefnd 3. útgáfa handbókarinnar ekki viðmiðin til að ákvarða samsetningu skotmarka, með áherslu á að leiðbeiningarnar sem framleiðandinn gefur skulu gilda.Frá og með fimmtu útgáfu leiðbeininganna hafa tvö markmið verið skýrð, sérstaklega matsviðmið fyrir eitt skotmark sem erfitt er að dæma um.Það er, ef rannsóknarstofan vill staðfesta að tilfelli sé jákvætt fyrir SARS-CoV-2 kjarnsýruuppgötvun, þarf eftirfarandi að vera uppfyllt 1 af 2 skilyrðum:

(1) Tvö markmið af SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) í sama sýni eru jákvætt með rauntíma flúrljómandi RT-PCR.Ef eitt mark er jákvætt er þörf á endurtöku sýna og endurprófunar.Ef prófunarniðurstöðurnar eru Ef eina markið er enn jákvætt er það metið sem jákvætt.

(2) Tvö sýni af rauntíma flúrljómandi RT-PCR sýndu eitt mark jákvætt á sama tíma eða tvö sýni af sömu gerð sýndu eina mark jákvæða niðurstöðu, sem hægt er að dæma sem jákvæða.Hins vegar leggja leiðbeiningarnar einnig áherslu á að neikvæðar niðurstöður kjarnsýruprófa geti ekki útilokað SARS-CoV-2 sýkingu.Útiloka þarf þætti sem geta valdið fölskum neikvæðum, þar á meðal léleg gæði sýna (öndunarsýni úr munnkoki og öðrum hlutum), sýnatöku of snemma eða of seint, sýni voru ekki geymd, flutt og unnin á réttan hátt og tæknin sjálf hafði vandamál (vírusbreytingar, PCR hömlun) o.s.frv.

Orsakir rangra neikvæða í SARS-CoV-2 uppgötvuninni

Hugtakið „falsk neikvæð“ í kjarnsýruprófum, sem nú er um að ræða, vísar oft til „falskar neikvætt“ þar sem niðurstöður kjarnsýruprófa eru í ósamræmi við klínískar birtingarmyndir, það er að segja að klínísk einkenni og myndgreiningarniðurstöður séu mjög grunaðir um COVID-19, en kjarnsýrupróf eru alltaf „neikvæðar“ oft.Klíníska rannsóknarstofan hjá heilbrigðisnefndinni útskýrði „falsk neikvæð“ SARS-CoV-2 prófið.

(1) Það er ákveðið magn af vírus í frumum sýkta einstaklingsins.Fyrirliggjandi gögn sýna að eftir að líkaminn er sýktur af veirunni fer veiran inn í hálsinn í gegnum nefið og munninn, síðan í barkann og berkjurnar og berst síðan í lungnablöðrurnar.Sýkti einstaklingurinn mun upplifa meðgöngutímann, væg einkenni og síðan ferlið alvarlegra einkenna og mismunandi stig sjúkdómsins.Og magn vírusa sem er til staðar í mismunandi hlutum líkamans er mismunandi.

Hvað varðar veiruálag frumutegunda, þekjufrumna í lungnablöðrum (neðri öndunarvegi)> þekjufrumum í öndunarvegi (efri öndunarvegi)> vefjafrumur, æðaþelsfrumur og átfrumur o.s.frv.;úr sýnistegundinni, lungnablöðruskolunarvökvi (framúrskarandi)>djúpur hóstahráki>nefkoksþurrkur>munnkoksþurrkur>blóð.Að auki er hægt að greina veiruna í saur.Hins vegar, með tilliti til þæginda við aðgerð og samþykki sjúklinga, er algengasta klíníska sýnispöntunin munnkoksþurrkur> nefkoksþurrku> berkjuskolunarvökvi (flókin aðgerð) og djúpur hráki (venjulega þurr hósti, erfitt að fá).

Þess vegna er magn veira í frumum munnkoks eða nefkoks sumra sjúklinga lítið eða mjög lítið.Ef aðeins eru tekin sýni úr munnkoki eða nefkoki til prófunar, greinist veirukjarnasýran ekki.

(2) Engum frumum sem innihéldu veiru var safnað við sýnatöku eða veirukjarnasýra var ekki varðveitt á áhrifaríkan hátt.

[① Óviðeigandi söfnunarstaður, til dæmis, við söfnun munnkoksþurrkanna, er söfnunardýptin ekki næg, þeim sem safnað er úr nefkokinu er ekki safnað djúpt í nefholinu osfrv. Flestar frumurnar sem safnað er geta verið veirulausar frumur;

②Sýnaþurrkur eru notaðar á rangan hátt.Til dæmis er mælt með gervitrefjum eins og PE trefjum, pólýester trefjum og pólýprópýlen trefjum fyrir efni þurrkuhaussins.Náttúrulegar trefjar eins og bómull eru notaðar í raunverulegri notkun (sterkt aðsog próteins og ekki auðvelt að þvo út) Og nylon trefjar (lélegt vatnsupptökur, sem leiðir til ófullnægjandi sýnatökurúmmáls);

③Röng notkun vírusgeymsluröra, svo sem misnotkun á pólýprópýleni eða pólýetýlenplastgeymslurörum sem auðvelt er að gleypa kjarnsýrur (DNA/RNA), sem leiðir til lækkunar á styrk kjarnsýra í geymslulausninni.Í reynd er mælt með því að nota pólýetýlen-própýlen fjölliða plast og nokkur sérmeðhöndluð pólýprópýlen plastílát til að geyma veirukjarnsýrur.]

[① Óviðeigandi söfnunarstaður, til dæmis, við söfnun munnkoksþurrkanna, er söfnunardýptin ekki næg, þeim sem safnað er úr nefkokinu er ekki safnað djúpt í nefholinu osfrv. Flestar frumurnar sem safnað er geta verið veirulausar frumur;

②Sýnaþurrkur eru notaðar á rangan hátt.Til dæmis er mælt með gervitrefjum eins og PE trefjum, pólýester trefjum og pólýprópýlen trefjum fyrir efni þurrkuhaussins.Náttúrulegar trefjar eins og bómull eru notaðar í raunverulegri notkun (sterkt aðsog próteins og ekki auðvelt að þvo út) Og nylon trefjar (lélegt vatnsupptökur, sem leiðir til ófullnægjandi sýnatökurúmmáls);

③Röng notkun vírusgeymsluröra, svo sem misnotkun á pólýprópýleni eða pólýetýlenplastgeymslurörum sem auðvelt er að gleypa kjarnsýrur (DNA/RNA), sem leiðir til lækkunar á styrk kjarnsýra í geymslulausninni.Í reynd er mælt með því að nota pólýetýlen-própýlen fjölliða plast og nokkur sérmeðhöndluð pólýprópýlen plastílát til að geyma veirukjarnsýrur.]

(4) Starfsemi klínískra rannsóknarstofu er ekki staðlað.Sýnaflutningur og geymsluaðstæður, staðlað rekstur klínískra rannsóknarstofa, túlkun niðurstaðna og gæðaeftirlit eru lykilatriði til að tryggja nákvæmni og áreiðanleika prófunarniðurstaðna.Samkvæmt niðurstöðum ytra gæðamats sem framkvæmd var af Klínískri rannsóknarstofu Heilbrigðisnefndar 16.-24. mars 2020, af 844 rannsóknarstofum sem fengu gildar niðurstöður, voru 701 (83,1%) hæfir og 143 (16,9%) ekki.Hæfur, heildarprófunarskilyrði á rannsóknarstofu eru góð, en mismunandi rannsóknarstofur hafa enn mun á starfsgetu starfsfólks, getu til að túlka sýnishorn með einu marki og gæðaeftirlit.

Hvernig á að draga úr fölsku neikvæðu við SARS-CoV-2 kjarnsýruuppgötvun?

Að draga úr fölskum neikvæðum í kjarnsýrugreiningu ætti að vera fínstillt út frá fjórum þáttum þess að framleiða falskar neikvæðar.

(1) Það er ákveðið magn af vírus í frumum sýkta einstaklingsins.Styrkur veirunnar í mismunandi líkamshlutum grunaðra sýkta einstaklinga mun vera mismunandi á mismunandi tímum.Ef það er ekkert kok getur það verið í berkjuskolunarvökva eða saur.Ef hægt er að safna mörgum tegundum sýna á sama tíma eða á mismunandi stigum sjúkdómsframvindu til að prófa, mun hjálpa til við að forðast rangar neikvæðar.

(2) Safna skal frumum sem innihalda veiru meðan á sýnatöku stendur.Þetta vandamál er hægt að leysa að miklu leyti með því að efla þjálfun sýnasafnara.

(3) Áreiðanleg IVD hvarfefni.Með því að framkvæma rannsóknir á mati á greiningarárangri hvarfefna á landsvísu og ræða núverandi vandamál, er hægt að bæta greiningarvirkni hvarfefna enn frekar og bæta næmni greiningar.

(4) Stöðluð rekstur klínískra rannsóknarstofa.Með því að efla þjálfun starfsfólks á rannsóknarstofum, stöðugt bæta gæðastjórnunarkerfið á rannsóknarstofum, tryggja sanngjarna skiptingu og bæta getu starfsfólks til að uppgötva, er hægt að draga úr fölskum neikvæðum vegna óviðeigandi rannsóknarstofu.

Ástæður fyrir endurtekningu á SARS-CoV-2 kjarnsýruprófi í bata og útskrifuðum sjúklingum

„COVID-19 greiningar- og meðferðaráætlunin (Sjöunda útgáfa prufa)“ kveður skýrt á um að eitt af forsendum þess að COVID-19 sjúklingar verði læknaðir og útskrifaðir af sjúkrahúsi er að tvö samfelld öndunarvegssýni séu með neikvætt kjarnsýrupróf (að minnsta kosti sólarhrings millibili), en það eru mjög fáir.

(1) SARS-CoV-2 er ný vírus.Nauðsynlegt er að skilja frekar sjúkdómsvaldandi verkun þess, heildarmynd sjúkdómsins sem orsakast og einkenni sjúkdómsferlisins.Því er annars vegar nauðsynlegt að efla stjórnun útskrifaðra sjúklinga og stunda 14 daga læknisskoðun.Framkvæma eftirfylgni, heilsufarseftirlit og heilsuleiðbeiningar til að dýpka skilning á öllu ferlinu um tilvik, þróun og útkomu sjúkdómsins.

(2) Sjúklingurinn gæti verið sýktur af veirunni aftur.Fræðimaðurinn Zhong Nanshan sagði: Vegna þess að læknaðir sjúklingar hafa mótefni er hægt að útrýma SARS-CoV-2 með mótefnum þegar þeir ráðast inn aftur.Það eru margar ástæður, sem geta verið orsök sjúklingsins sem batnar, eða það getur tengst stökkbreytingu veirunnar, eða jafnvel orsök rannsóknarstofuprófa.Ef það er vírusinn sjálfur, getur SARS-CoV-2 stökkbreytingin valdið því að mótefnið sem batnaði sjúklingurinn framleiðir sé óvirkt gegn stökkbreyttu vírusnum.Ef sjúklingurinn er aftur sýktur af stökkbreyttu veirunni getur kjarnsýruprófið verið jákvætt aftur.

(3) Að því er varðar prófunaraðferðir á rannsóknarstofu hefur hver prófunaraðferð sína takmarkanir.SARS-CoV-2 kjarnsýruuppgötvun er vegna vals á genaröð, samsetningu hvarfefna, næmi aðferðarinnar og annarra ástæðna, sem leiðir til þess að núverandi sett hafa sín eigin neðri greiningarmörk.Eftir að sjúklingurinn er meðhöndlaður minnkar veiran í líkamanum.Þegar veiruálag í sýninu sem á að prófa er undir neðri greiningarmörkum mun „neikvæð“ niðurstaða birtast.Hins vegar þýðir þessi niðurstaða ekki að veiran í líkamanum sé alveg horfin.Veiran getur verið eftir að meðferð er hætt.Resurgence", haltu áfram að afrita.Því er mælt með því að endurskoða það einu sinni í viku innan 2 til 4 vikna eftir útskrift.

(4) Kjarnsýra er erfðaefni veirunnar.Veiran er drepin eftir að sjúklingurinn hefur gengist undir veirueyðandi meðferð, en veiru-RNA brotin sem eftir eru eru enn geymd í mannslíkamanum og losna ekki alveg úr líkamanum.Stundum, undir vissum kringumstæðum, getur það verið haldið meira.Langur tími, og á þessum tíma mun kjarnsýruprófið vera „tímabundið“ jákvætt.Með framlengingu á batatíma sjúklingsins, eftir að RNA-leifarnar í líkamanum eru smám saman kláraðar, getur niðurstaða kjarnsýruprófsins orðið neikvæð.

(5) Niðurstaða úr kjarnsýruprófi SARS-CoV-2 sannar aðeins tilvist eða fjarveru veiru-RNA og getur ekki sannað virkni veirunnar og hvort veiran sé smitandi.Nauðsynlegt er að sanna hvort sjúklingur sem er með jákvætt kjarnsýrupróf aftur verði uppspretta sýkingar á ný.Nauðsynlegt er að framkvæma veiruræktun á klínískum sýnum og rækta „lifandi“ vírus til að sanna að hún sé smitandi.

Samantekt

Í stuttu máli er ekki hægt að forðast að fullu SARS-CoV-2 kjarnsýrupróf, rangar neikvæðar niðurstöður, jákvæðar endurprófanir og aðrar aðstæður sem eru í ósamræmi við klínískar einkenni.Í raunverulegri skimun og prófun er mælt með því að sameina klínísk einkenni, myndgreiningarrannsóknir (CT) og tilraunir Niðurstöður úr rannsóknarstofuprófi (kjarnsýrupróf + veirusértæk mótefnapróf) fyrir alhliða greiningu til að koma í veg fyrir að greining hafi gleymst og ranga greiningu.Ef prófunarniðurstöðurnar eru augljóslega í ósamræmi við klínískar einkenni, er mælt með því að framkvæma ítarlega greiningu á öllu prófunartenglinum (sýnasöfnun, blóðrás og vinnslutenglar) til að útiloka SARS-CoV-2 veiru snemma sýkingu, endurtekna sýkingu eða samhliða öðrum öndunarfæraveirusýkingum o.s.frv.Ef aðstæður leyfa er mælt með því að safna viðkvæmari sýnum eins og hráka eða lungnablöðruskolunarvökva til endurskoðunar.

Skyldar vörur:

SARS-CoV-2 kjarnsýrugreiningarsett (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method)