Ⅰ. Auka næmni hvarfkerfisins:

1. Aðskilja hágæða RNA:

Árangursrík cDNA nýmyndun kemur frá hágæða RNA.Hágæða RNA ætti að tryggja að minnsta kosti heildarlengd og inniheldur ekki hemla sem innihalda ekki skráningarensím, svo sem EDTA eða SDS.Gæði RNA ákvarða hámarksgildi raðupplýsinganna sem þú getur umritað á cDNA.Almenna RNA hreinsunaraðferðin er skrefsaðferð til að nota ísóósýanat/sýrófenól.Til að koma í veg fyrir mengun RNase þarf RNA sem er aðskilið frá sýni sem er ríkt af RNase (eins og brisi) geymslu á formaldehýði til að spara hágæða RNA, sem er enn frekar fyrir langtíma geymslu.RNA sem dregið var úr rottu lifur var í grundvallaratriðum brotið niður eftir viku geymslu í vatni, en RNA sem dregið var úr rottumilta hélst stöðugt eftir þriggja ára geymslu í vatni.Auk þess eru afrit stærri en 4kb næmari fyrir niðurbroti RNase ummerki en lítil afrit.Til að auka stöðugleika geymslu RNA sýnisins er hægt að leysa RNA upp í methalamíni jóna og geymist -70 °C.Þýlid sem notað er til að bjarga RNA má ekki innihalda ýmislegt sem brýtur niður RNA.RNA, sem er unnið úr brisi, er hægt að vista í methalamíni í að minnsta kosti eitt ár.Þegar þú ert tilbúinn að nota RNA geturðu notað eftirfarandi aðferðir til að fella út RNA: Bættu NaCl við 0,2m og 4 sinnum rúmmál etanóls, settu stofuhita í 3-5 mínútur og 10.000 × g miðflótta í 5 mínútur.

2. Notaðu bakrit án RNaseH virkni (RNaseH-):

RNasa hemlum er oft bætt við við öfug umritunarviðbrögð til að auka lengd og afrakstur cDNA nýmyndunar.RNasa hemli er bætt við í fyrstu keðjumyndunarhvarfinu í nærveru jafna og afoxandi efna eins og DTT vegna þess að for-cDNA nýmyndunarferlið denaturerar hemilinn og losar þar með bundna RNasa sem brjóta niður RNA.Prótein RNase hemill kemur aðeins í veg fyrir niðurbrot RNA af RNase A, B, C, og kemur ekki í veg fyrir RNase á húðinni, þannig að gæta skal þess að koma ekki RNase frá fingrum þrátt fyrir notkun þessara hemla.

Reverse transcriptase hvatar umbreytingu RNA í cDNA.Bæði M-MLV og AMV hafa innræna RNaseH virkni til viðbótar við eigin pólýmerasa virkni.RNaseH virkni keppir við pólýmerasa virkni um arfblendna þræði sem myndast á milli RNA sniðmáts og DNA primers eða cDNA framlengingarþráða og brýtur niður RNA: RNA þræði í DNA fléttum.Ekki er lengur hægt að nota RNA sniðmát sem brotnað er niður af RNaseH virkni sem áhrifarík hvarfefni fyrir cDNA nýmyndun, sem dregur úr afrakstur og lengd cDNA nýmyndunar.Þannig væri mikill ávinningur að útrýma eða draga mjög úr RNaseH virkni bakrita.

SuperScriptⅡ bakrit, MMLV bakrit af RNaseH- og thermoScript bakrit, AMV af RNaseH- gaf meira cDNA í fullri lengd en MMLV og AMV.RT-PCR næmi hefur áhrif á magn cDNA sem er búið til.ThermoScript er miklu næmari en AMV.Stærð RT-PCR afurða takmarkast af getu bakrita til að búa til cDNA, sérstaklega þegar stærri Cdna eru klónuð.Í samanburði við MMLV jók SuperScripⅡ verulega ávöxtun langra RT-PCR vara.Bakrit RNaseH- eykur einnig hitastöðugleika, þannig að hvarfið er hægt að framkvæma við hærra hitastig en eðlilegt er, 37-42 ℃.Við fyrirhugaðar nýmyndunarskilyrði voru oligo(dT) primers og 10μCi [alfa-p]dCTP notaðir.Heildarframleiðsla fyrstu keðjunnar var reiknuð út með TCA úrkomuaðferðinni.cDNA í fullri lengd var greint með því að fjarlægja stærðarflokkaða strimla og telja í basísku agarósa hlaupi.

3. Auka hita varðveisluhita öfugri umritun:

Hærra hitastig hjálpar til við að opna aukabyggingu RNA og auka afrakstur hvarfsins.Fyrir flest RNA sniðmát, að halda RNA og primernum við 65°C án biðminni eða salts og síðan kæla þau fljótt á ís útrýma flestum efri byggingum og leyfa primerunum að bindast.Hins vegar hafa sum sniðmát enn aukabyggingu, jafnvel eftir hitauppstreymi.Mögnun á þessum erfiðu sniðmátum er hægt að framkvæma með því að nota ThermoScript bakrit og með því að setja bakritsviðbrögð við hærra hitastig til að bæta mögnun.Hærra geymsluhitastig getur einnig aukið sérhæfni, sérstaklega þegar cDNA nýmyndun er framkvæmd með því að nota genasértæka grunna (GSPS) (sjá kafla 3).Ef þú notar GSP skaltu ganga úr skugga um að Tm gildi grunnsins sé það sama og væntanlegt hitastig.Ekki nota oligo(dT) og handahófskennda primera yfir 60 ℃.Tilviljunarkennd grunnur þarf að halda við 25 ℃ í 10 mínútur áður en þær hækka í 60 ℃.Auk þess að nota hærra öfugumritunarhitastig er hægt að bæta sérhæfni með því að flytja RNA/ grunnblönduna beint úr 65 ℃ eðlishitastiginu yfir í öfuga umritunarhitastigið og bæta við forhitaðri 2× hvarfblöndu (cDNA varma upphafsmyndun).Þessi nálgun hjálpar til við að koma í veg fyrir millisameindabasapörun sem á sér stað við lægra hitastig.Notkun PCR tækis einfaldar marga hitarofa sem þarf fyrir RT-PCR.

Tth hitastöðugaður pólýmerasi virkar sem DNA pólýmerasi í viðurvist Mg2+ og RNA pólýmerasi í viðurvist Mn2+.Það getur haldið hita við allt að 65 ℃.Hins vegar, tilvist Mn2+ við PCR dregur úr tryggð, sem gerir Tth pólýmerasa minna hentugur fyrir mikla nákvæmni mögnun, eins og cDNA klónun.Að auki er Tth minna skilvirkt við öfuga umritun, sem dregur úr næmni, og þar sem eitt ensím getur framkvæmt öfuga umritun og PCR, er ekki hægt að nota stjórnviðbrögð án öfugumritunar til að greina magnaðar afurðir cDNA frá menguðu erfðaefnis DNA.

4. Aukefni sem stuðlar að öfugum umritun:

Að bæta við aukefnum, þar með talið glýseríni og DMSO, við fyrstu keðjumyndunarhvarfið getur dregið úr stöðugleika kjarnsýru tvístrengsins og vinda ofan af RNA aukabyggingunni.Hægt er að bæta við allt að 20% glýseríni eða 10% DMSO án þess að hafa áhrif á virkni SuperScriptⅡ eða MMLV.AMV þolir einnig allt að 20% glýseról án þess að draga úr virkni.Til að hámarka næmi RT-PCR í SuperScriptⅡ öfugumritunarviðbrögðum er hægt að bæta við 10% glýseróli og einangra við 45℃.Ef 1/10 af umritunarviðbragðsafurðinni er bætt við PCR er styrkur glýseróls í mögnunarhvarfinu 0,4%, sem er ekki nóg til að hamla PCR.

5. RNaseH vinnsla:

Hægt er að bæta næmni með því að meðhöndla viðbrögð við myndun cDNA með RNaseH fyrir PCR.Fyrir sum sniðmát er talið að RNA í cDNA myndun hvarfsins komi í veg fyrir bindingu mögnuðra vara, en þá getur RNaseH meðferðin aukið næmi.Almennt er þörf á RNaseH meðferð fyrir mögnun á tiltölulega löngu cDNA marksniðmáti í fullri lengd, eins og tuberous scherosisⅡ með lágri afriti.Fyrir þetta erfiða sniðmát, jók RNaseH merkið sem myndast af cDNA sem er búið til með SuperScriptⅡ eða AMV.Fyrir flest RT-PCR viðbrögð er RNaseH meðferð valfrjáls vegna þess að 95 ℃ einangraða PCR denaturation þrep vatnsrýrir venjulega RNA úr RNA: DNA flókinu.

6. Bættar aðferðir til að greina lítið magn af RNA:

RT-PCR er sérstaklega krefjandi þegar aðeins lítið magn af RNA er tiltækt.Viðbót á glýkógeni sem burðarefni við RNA aðskilnað hjálpar til við að auka afrakstur lítilla sýna.Hægt er að bæta við RNase-fríu glýkógeni á sama tíma og Trizol.Glýkógen er vatnsleysanlegt og getur verið í vatnsfasanum með RNA til að aðstoða við síðari úrkomu.Ráðlagður styrkur RNase-frís glýkógens er 250μg/ml fyrir sýni sem eru minna en 50 mg af vefjum eða 106 ræktuðum frumum.

Að bæta við asetýleruðu BSA til að snúa við umritunarviðbrögðum með því að nota SuperScriptⅡ getur aukið næmni, og fyrir lítið magn af RNA getur dregið úr magni SuperScriptⅡ og bætt við 40 einingum af RNaseOut kjarnahemli bætt greiningarstigið.Ef glýkógen er notað við RNA aðskilnað er samt mælt með því að bæta við BSA eða RNase hemlum til að snúa við umritunarviðbrögðum með SuperScriptⅡ.

Ⅱ. Auka sérhæfni RT-PCR

1. cNDA nýmyndun:

Hægt er að nota þrjár mismunandi aðferðir til að hefja myndun fyrsta strengs cDNA og hlutfallsleg sérhæfni hverrar aðferðar hefur áhrif á magn og gerð cDNA sem er búið til.

Random primer aðferð er minnst sértæka af þessum þremur aðferðum.Primers eru tengdir á mörgum stöðum í gegnum afritið til að framleiða stutt cDNA að hluta.Þessi aðferð er oft notuð til að fá 5′ endanlegar raðir og cDNA úr RNA sniðmátum með efri byggingarsvæðum eða með stöðvunarstöðum sem öfug umskrift getur ekki endurtekið.Til að fá lengsta cDNA þarf að ákvarða hlutfall primers og RNA í hverju RNA sýni með reynslu.Upphafsstyrkur handahófskenndra grunna er á bilinu 50 til 250ng á 20μl hvarfkerfi.Vegna þess að cDNA sem er myndað úr heildar-RNA með því að nota handahófskennda frumur er aðallega ríbósómal RNA, er pólý(A)+RNA almennt valið sem sniðmát.

Oligo(dT) ræsing er sértækari en tilviljunarkennd primers.Það blandar saman við poly(A) hala sem finnast í 3′ enda mRNA í flestum heilkjörnungafrumum.Vegna þess að pólý(A)+RNA er u.þ.b. 1% til 2% af heildar-RNA, er magn og flókið cDNA mun minna en ef tilviljunarkennd frumur væru notaðir.Vegna mikillar sérhæfni þess þarf oligo(dT) almennt ekki hagræðingu fyrir RNA til primer hlutfalls og pólý(A)+ val.Mælt er með því að nota 0,5μg oligo(dT) fyrir hvert 20μl hvarfkerfi.oligo(dT)12-18 hentar flestum RT-PCR.ThermoScript RT-PCR kerfið veitir oligo(dT)20 vegna góðs hitastöðugleika og hentar fyrir hærra hitastig.

Gensértækir primers (GSP) eru bestu sértæku primersarnir fyrir öfuga umritunarskrefið.GSP er andsense oligonucleoside sem getur sérstaklega blandað saman við RNA ákvörðunarraðir, frekar en að sameina öll Rnas eins og tilviljunarkenndar primers eða oligo(dT).Reglurnar sem notaðar eru til að hanna PCR primera eiga einnig við um hönnun öfugumritunarviðbragða GSP.GSP getur verið sama röð og mögnunargrunnurinn sem tengdur er í lok mRNA3′, eða GSP getur verið hannaður til að vera tengdur niðurstreymis með öfugri mögnunargrunninum.Fyrir suma uppmagnaða hluti er nauðsynlegt að hanna fleiri en einn andsense primer fyrir árangursríka RT-PCR vegna þess að aukabygging mark-RNA getur komið í veg fyrir að primerinn bindist.Mælt er með því að nota 1pmol andsense GSP í fyrsta keðjumyndunarviðbragðskerfinu sem er 20μl.

2. Auka hita varðveisluhita öfugri umritun:

Til þess að nýta GSP sérhæfni til fulls ætti að nota bakrita með miklum hitastöðugleika.Hægt er að einangra hitastöðugan bakrit við hærra hitastig til að auka viðbragðsstífni.Til dæmis, ef GSP er gleypið við 55°C, þá er sérhæfni GSP ekki nýtt að fullu ef öfug umritun er framkvæmd við 37°C með lítilli hörku með því að nota AMV eða M-MLV.Hins vegar geta SuperScripⅡ og ThermoScript brugðist við 50 ℃ eða hærra, sem útilokar ósértækar vörur sem eru framleiddar við lægra hitastig.Til að fá hámarks sérhæfni er hægt að flytja RNA/ grunnblönduna beint frá 65 ℃ denatureringshitastigi yfir í öfuga umritunarhitastigið með því að bæta við forhitaðri 2x hvarfblöndu (hitaupphaf cDNA nýmyndunar).Þetta hjálpar til við að koma í veg fyrir basapörun milli sameinda við lágt hitastig.Notkun PCR tækis einfaldar margar hitabreytingar sem þarf fyrir RT-PCR.

3. Draga úr erfðafræðilegri DNA mengun:

Einn hugsanlegur erfiðleiki við RT-PCR er að RNA mengar erfðafræðilegt DNA.Notkun betri RNA aðskilnaðaraðferða, eins og Trizol Reagent, dregur úr erfðamengun DNA í RNA efnablöndur.Til að forðast vörur sem eru framleiddar úr erfðafræðilegu DNA, er hægt að meðhöndla RNA með mögnunargráðu DnasⅠ til að fjarlægja mengað DNA fyrir öfuga umritun.Sýnin voru geymd við 65 ℃ í 2,0 mM EDTA í 10 mínútur til að stöðva DNaseⅠ meltingu.EDTA klóar magnesíumjónir til að koma í veg fyrir magnesíumjónaháða RNA vatnsrof sem á sér stað við háan hita.

Til þess að aðskilja magnað cDNA frá erfðamengi DNA mögnunarafurðinni er hægt að hanna primera sem sameinast sérstaklega með aðskilinni exon.PCR vörur unnar úr cDNA verða styttri en þær sem unnar eru úr menguðu erfðaefni DNA.Stýrð tilraun án öfugumritunar er einnig gerð á hverju RNA sniðmáti til að ákvarða hvort tiltekið brot sé úr erfðafræðilegu DNA eða cDNA.PCR afurðir sem fást í fjarveru öfugumritunar eru fengnar úr erfðamenginu.

Tengd vara

RT-PCR Auðvelt^ᵀᴹég (Eitt skref)

-Einsþrepa settið gerir öfugumritun og PCR kleift að framkvæma í sömu túpunni.Það þarf aðeins að bæta við sniðmáti RNA, sérstökum PCR primers og RNase-Free ddH₂O.

- Rauntíma magngreiningu á RNA er hægt að framkvæma hratt og örugglega.

- Settið notar einstakt Foregene öfugt umritunarefni og Foregene HotStar Taq DNA pólýmerasa ásamt einstöku hvarfkerfi til að bæta mögnunarvirkni og sérhæfni hvarfsins á áhrifaríkan hátt.

-Bjartsýni hvarfkerfisins gerir hvarfið meira greiningarnæmi, sterkari hitastöðugleika og betra þol.

RT Easy II(Með GDNase) Master Premix fyrir fyrsta flokks CDNA myndun fyrir rauntíma PCR með GDNase

-Árangursrík hæfni til að fjarlægja gDNA, sem getur fjarlægt gDNA í sniðmátinu innan 2 mínútna.

- Skilvirkt öfugt umritunarkerfi, það tekur aðeins 15 mínútur að klára myndun fyrsta strengs cDNA.

-Flókin sniðmát: sniðmát með hátt GC innihald og flókna aukabyggingu er einnig hægt að snúa við með mikilli skilvirkni.

-Hátt næmt öfugt umritunarkerfi, pg-stigi sniðmát geta einnig fengið hágæða cDNA.

- Öfug umritunarkerfið hefur mikinn hitastöðugleika, ákjósanlegur hvarfhiti er 42 ℃ og það hefur enn góða öfuga umritunarafköst við 50 ℃.