RT-qPCR er þróað úr venjulegri PCR tækni.Það bætir flúrljómandi efnum (flúrljómandi litarefni eða flúrljómandi rannsaka) við hefðbundið PCR hvarfkerfi og greinir PCR glæðingar- og framlengingarferlið í rauntíma í samræmi við mismunandi lýsandi kerfi þeirra.Fluorescent merkjabreytingar í miðlinum eru notaðar til að reikna út magn vörubreytinga í hverri lotu PCR.Eins og er eru algengustu aðferðirnar flúrljómandi litunaraðferð og rannsakaaðferð.

Flúrljómandi litunaraðferð:
Sum flúrljómandi litarefni, eins og SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO o.s.frv., gefa ekki frá sér ljós af sjálfu sér, heldur gefa frá sér flúrljómun eftir að hafa bundist við minniháttar gróp dsDNA.Þess vegna, í upphafi PCR viðbragðsins, getur vélin ekki greint flúrljómunarmerkið.Þegar hvarfið heldur áfram í glæðingarframlenginguna (tveggja þrepa aðferð) eða framlengingarstigið (þriggja þrepa aðferð) eru tvöfaldir þræðir opnaðir á þessum tíma og nýi DNA-pólýmerasinn Við myndun strengja eru flúrljómandi sameindir sameinuð í dsDNA minni gróp og gefa frá sér flúrljómun.Eftir því sem fjöldi PCR-lota eykst, sameinast fleiri og fleiri litarefni við dsDNA og flúrljómunarmerkið er einnig stöðugt aukið.Tökum SYBR Green Ⅰ sem dæmi.
Rannsóknaraðferð:
Taqman rannsakandi er algengasti vatnsrofsneminn.Það er flúrljómandi hópur í 5′ enda rannsakans, venjulega FAM.Kanninn sjálfur er röð sem er viðbót við markgenið.Það er flúrljómandi slökkvihópur í 3′ enda flúorfórsins.Samkvæmt meginreglunni um flúrljómunarorkuflutning (Förster resonance energy transfer, FRET), þegar fréttaskýrandi flúrljómandi hópur (gjafaflúrljómandi sameind) og slökkandi flúrljómandi hópur (viðtakar flúrljómandi sameind) Þegar örvunarróf skarast og fjarlægðin er mjög nálægt (7-10 sameind flúrefnisins) viðtaksameindina, en sjálfflúrljómunin er veik.Þess vegna, í upphafi PCR-hvarfsins, þegar rannsakandinn er laus og ósnortinn í kerfinu, mun skýrslugerandi flúrljómandi hópurinn ekki gefa frá sér flúrljómun.Við glæðingu bindast grunnurinn og rannsakarinn við sniðmátið.Á framlengingarstigi myndar pólýmerasinn stöðugt nýjar keðjur.DNA pólýmerasi hefur 5′-3′ exonucleasa virkni.Þegar komið er í rannsakann mun DNA-pólýmerasinn vatnsrjúfa rannsakann úr sniðmátinu, aðskilja reporter-flúrljómandi hópinn frá quencher-flúrljómandi hópnum og gefa út flúrljómandi merkið.Þar sem það er eitt-á-mann samband á milli rannsakans og sniðmátsins, er rannsakaaðferðin betri en litunaraðferðin hvað varðar nákvæmni og næmi prófsins.

Mynd 1 Meginregla qRT-PCR

Grunnhönnun
Meginreglur:

Primerarnir ættu að vera hannaðir á varðveitta svæðinu í kjarnsýruröðinni og hafa sérhæfni.

Best er að nota cDNA röð og mRNA röð er einnig ásættanleg.Ef ekki, finndu út hönnun á cds svæði DNA röðarinnar.
Lengd flúrljómandi magnafurðarinnar er 80-150bp, sú lengsta er 300bp, grunnlengdin er almennt á milli 17-25 basar og munurinn á upstream og downstream primers ætti ekki að vera of mikill.

G+C innihaldið er á milli 40% og 60% og 45-55% er best.
TM gildi er á bilinu 58-62 gráður.
Reyndu að forðast primer dimers og self-dimers, (ekki birtast meira en 4 pör af samfelldum bösum) hárnálabyggingu, ef óhjákvæmilegt, gerðu ΔG<4,5kJ/mól* Ef þú getur ekki tryggt að gDNA hafi verið fjarlægt við öfuga umritun Hreinsið, það er best að hanna grunnana á intron *3 má ekki vera modified, T′C-svæðið og G′C-svæðið. /C, A/G samfellda uppbyggingu (2-3) grunnur og ó-
sérstakt Sameining misjafnlega mögnuðu raðarinnar er helst minni en 70% eða hefur 8 fyllingarbasa samlíkingu.
Gagnagrunnur:
CottonFGD leit eftir leitarorðum
Grunnhönnun:
IDT-qPCR grunnhönnun

Fig2 IDT á netinu grunnur hönnun tól síða

Mynd 3 niðurstöðusíðuskjár
Hönnun lncRNA primers:
lncRNA:sömu skref og mRNA.
miRNA:Meginreglan um stofnlykkjaaðferðina: Þar sem öll miRNA eru stuttar raðir upp á um 23 nt er ekki hægt að framkvæma beina PCR uppgötvun og því er stofnlykkjaröðunartólið notað.Stofnlykkjaröðin er einþátta DNA um það bil 50 nt, sem getur myndað hárnálabyggingu af sjálfu sér.3 Hægt er að hanna endann sem röð sem er viðbót við miRNA hlutabrotið, síðan er hægt að tengja markmiRNA við stofnlykkjaröðina við öfuga umritun og heildarlengdin getur orðið 70bp, sem er í samræmi við lengd mögnuðu vörunnar sem ákvarðast með qPCR.Tailing miRNA grunnur hönnun.
Mögnunarsértæk uppgötvun:
Blast gagnagrunnur á netinu: CottonFGD sprengja eftir röð líkt
Staðbundin sprengja: Vísaðu til að nota Blast+ til að gera staðbundna sprengingu, Linux og Macos geta beint komið á staðbundnum gagnagrunni, win10 kerfi er einnig hægt að gera eftir að ubuntu bash hefur verið sett upp.Búðu til staðbundinn sprengigagnagrunn og staðbundinn sprengingu;opnaðu ubuntu bash á win10.
Athugið: Bómull í hálendinu og sjóeyjabómull eru fjórfjórlaga ræktun, þannig að útkoman af sprengingu verður oft tvær eða fleiri eldspýtur.Í fortíðinni, með því að nota NAU geisladiska sem gagnagrunn til að framkvæma sprengingu, er líklegt að finna tvö einsleit gen með aðeins nokkrum SNP mun.Venjulega er ekki hægt að aðskilja tvö einsleit gen með grunnhönnun, þannig að þau eru meðhöndluð sem eins.Ef það er augljóst indel er primerinn venjulega hannaður á indelinu, en það getur leitt til aukabyggingar primersins. Frjáls orka verður hærri, sem leiðir til lækkunar á mögnunarvirkni, en það er óhjákvæmilegt.

Greining á efri grunnbyggingu:
Skref:opna oligo 7 → innsláttur sniðmátsröð → loka undirglugga → vista → finndu grunnur á sniðmáti, ýttu á ctrl+D til að stilla lengd grunns → greina ýmsar aukabyggingar, svo sem sjálfdímerun líkama, heterodimer, hárnál, misræmi, o.s.frv. Síðustu tvær myndirnar á mynd 4 eru prófunarniðurstöður grunnanna.Niðurstaðan af framhliðinni er góð, það er engin augljós dimer og hárnála uppbygging, engin samfelld viðbót basar, og algildi frjálsrar orku er minna en 4,5, en bakgrunnurinn sýnir samfellda.auk þess kemur alvarlegri dimer fram í 3′ endanum og dimer með 4 basum í röð.Þó að ókeypis orkan sé ekki mikil, getur 3′ dimer Chl haft alvarleg áhrif á mögnunarsérhæfni og mögnunarvirkni.Að auki er nauðsynlegt að athuga hvort hárnálar, heteródímerar og misjafnar séu til.

Fig3 oligo7 uppgötvunarniðurstöður
Uppgötvun mögnunarvirkni:
Mögnunarvirkni PCR hvarfsins hefur alvarleg áhrif á PCR niðurstöðurnar.Einnig í qRT-PCR er mögnunarvirknin sérstaklega mikilvæg fyrir megindlegar niðurstöður.Fjarlægðu önnur efni, vélar og samskiptareglur í hvarflausninni.Gæði primeranna hafa einnig mikil áhrif á mögnunarvirkni qRT-PCR.Til að tryggja nákvæmni niðurstaðnanna þurfa bæði hlutfallsleg flúrljómunarmagn og alger flúrljómunarmagngreining að greina mögnunarvirkni frumanna.Það er viðurkennt að skilvirk qRT-PCR mögnunarvirkni er á milli 85% og 115%.Það eru tvær aðferðir:
1. Hefðbundin ferilaðferð:
a.Blandaðu cDNA
b.Gradient þynning
c.qPCR
d.Línuleg aðhvarfsjafna til að reikna út mögnunarnýtni
2. LinRegPCR
LinRegPCR er forrit til að greina rauntíma RT-PCR gögn, einnig kölluð quantitative PCR (qPCR) gögn byggð á SYBR Green eða svipaðri efnafræði.Forritið notar gögn sem ekki eru leiðrétt í grunnlínu, framkvæmir grunnlínuleiðréttingu á hverju sýni fyrir sig, ákvarðar glugga-línuleika og notar síðan línulega aðhvarfsgreiningu til að passa beina línu í gegnum PCR gagnasettið.Út frá halla þessarar línu er PCR skilvirkni hvers einstaks sýnis reiknuð.Meðal PCR skilvirkni á magni og Ct gildi fyrir hvert sýni eru notuð til að reikna út upphafsstyrk fyrir hvert sýni, gefið upp í handahófskenndum flúrljómunareiningum.Gagnainntak og úttak er í gegnum Excel töflureikni.Aðeins sýnishorn
blöndun er nauðsynleg, enginn halli
skref eru nauðsynleg:(Tökum Bole CFX96 sem dæmi, ekki alveg Vél með skýrum ABI)
tilraun:það er staðlað qPCR tilraun.
qPCR gagnaúttak:LinRegPCR getur þekkt tvenns konar úttaksskrár: RDML eða magngreiningarmögnunarniðurstaða.Reyndar er það rauntíma greiningargildi hringrásarnúmersins og flúrljómunarmerkja vélarinnar og mögnunin er fengin með því að greina flúrljómunarbreytingargildi línulegra hluta skilvirkni.
Gagnaval: Fræðilega séð ætti RDML gildið að vera nothæft.Talið er að vandamálið við tölvuna mína sé að hugbúnaðurinn þekkir ekki RDML, þannig að ég hef excel úttaksgildið sem upprunalegu gögnin.Mælt er með því að framkvæma grófa skimun á gögnunum fyrst, svo sem að ekki hafi tekist að bæta við sýnum o.s.frv. Hægt er að eyða punktum í úttaksgögnum (að sjálfsögðu er ekki hægt að eyða þeim, LinRegPCR mun hunsa þessa punkta á seinna stigi)

Mynd 5 qPCR gagnaútflutningur

Mynd 6 val á sýnishornum umsækjenda

Gagnainntak:Opnaðu niðurstöður hæfismögnunar.xls, → opna LinRegPCR → skrá → lesa úr excel → veldu færibreytur eins og sýnt er á mynd 7 → OK → smelltu á ákvarða grunnlínur

Mynd 7 skref linRegPCR gagnainnsláttar

Niðurstaða:Ef það er engin endurtekning er engin þörf á flokkun.Ef það er endurtekning er hægt að breyta hópnum í sýnishópnum og er nafn gensins fært inn í auðkennið og þá verður sama gen sjálfkrafa flokkað.Að lokum skaltu smella á skrána, flytja út Excel og skoða niðurstöðurnar.Mögnunarvirkni og R2 niðurstöður hverrar holu verða sýndar.Í öðru lagi, ef þú skiptir í hópa, mun leiðrétt meðaltal mögnunarvirkni birtast.Gakktu úr skugga um að mögnunarvirkni hvers grunns sé á milli 85% og 115%.Ef það er of stórt eða of lítið þýðir það að mögnunarvirkni primersins er léleg.

Mynd 8 Niðurstaða og gagnaúttak

Tilraunaferli:
RNA gæðakröfur:
Hreinleiki:1.72,0 gefur til kynna að það gæti verið leifar af ísóþíósýanati.Hrein kjarnsýra A260/A230 ætti að vera um 2 .Ef það er sterkt frásog við 230 nm gefur það til kynna að það séu lífræn efnasambönd eins og fenatjónir.Að auki er hægt að greina það með 1,5% agarósa gel rafdrætti.Bendi á merkið, vegna þess að ssRNA hefur enga eðlisbreytingu og mólþyngdarlogaritminn hefur ekki línulegt samband og ekki er hægt að tjá sameindarþyngdina rétt.Einbeiting: Fræðilega séðekkiminna en 100ng/ul, ef styrkurinn er of lágur, er hreinleikinn yfirleitt lítill ekki hár

Fig9 RNA hlaup

Að auki, ef sýnið er dýrmætt og styrkur RNA er hár, er mælt með því að skammta það eftir útdrátt og þynna RNA í lokastyrk 100-300ng/ul fyrir öfuga umritun.Íferlið við öfuga umritun, þegar mRNA er umritað, eru oligo (dt) primers sem geta tengst polyA hala sérstaklega notaðir fyrir öfuga umritun, en lncRNA og circRNA nota handahófskennda hexamer (Random 6 mer) primera fyrir öfuga umritun á heildar RNA Fyrir miRNA eru miRNA sértækar hálslykkja bakritar notaðir fyrir hálslykkju bakrita.Mörg fyrirtæki hafa nú hleypt af stokkunum sérstökum skottpökkum.Fyrir stilk-lykkjuaðferðina er skottaðferðin þægilegri, afkastamikil og hvarfefnissparandi, en áhrif þess að greina miRNA af sömu fjölskyldu ætti ekki að vera eins góð og stofnlykkjuaðferðin.Hvert öfugt umritunarsett hefur kröfur um styrk genasértækra frumra (stöngullykkju).Innri viðmiðunin sem notuð er fyrir miRNA er U6.Í því ferli að snúa við stilklykkju ætti að snúa við túpu af U6 sérstaklega og bæta beint við framan og aftan grunninn af U6.Bæði circRNA og lncRNA geta notað HKG sem innri viðmiðun.ÍcDNA uppgötvun,
ef það er ekkert vandamál með RNA ætti cDNA líka að vera í lagi.Hins vegar, ef reynt er að fullkomna tilraunina, er best að nota innra viðmiðunargen (Reference gen, RG) sem getur greint gDNA frá geisladiskum.Almennt séð er RG heimilisgen., HKG) eins og sýnt er á mynd 10;Á þeim tíma var ég að búa til sojabaunageymsluprótein og notaði actin7 sem innihélt introns sem innri viðmiðun.Stærð magnaða brotsins af þessum grunni í gDNA var 452bp og ef cDNA var notað sem sniðmát var það 142bp.Þá komust niðurstöður úr prófunum að hluti af cDNA var í raun mengað af gDNA, og það sannaði líka að það var engin vandamál með niðurstöðu öfugumritunar, og það gæti verið notað sem sniðmát fyrir PCR.Það er gagnslaust að keyra agarósa gel rafdrætti beint með cDNA, og það er dreifð band, sem er ekki sannfærandi.

Mynd 10 cDNA uppgötvun

Ákvörðun qPCR skilyrðier almennt ekkert vandamál samkvæmt samskiptareglum settsins, aðallega í þrepinu tm gildi.Ef sumir primers eru ekki vel hannaðir við primer hönnun, sem veldur miklum mun á tm gildinu og fræðilegu 60°C, er mælt með því að cDNA Eftir að sýnin hafa verið blandað, keyrið halla PCR með primerum, og reyndu að forðast að stilla hitastigið án banda sem TM gildi.

Gagnagreining

Hefðbundin hlutfallsleg flúrljómunar magn PCR vinnsluaðferð er í grundvallaratriðum samkvæmt 2.-ΔΔCT.Gagnavinnslusniðmát.

Skyldar vörur:

Rauntíma PCR Auðvelt^TM -Taqman

Rauntíma PCR Auðvelt^TM –SYBR GRÆN I

RT Easy I (Master Premix fyrir fyrsta streng cDNA nýmyndun)

RT Easy II (Master Premix fyrir fyrsta streng cDNA nýmyndun fyrir qPCR)