PCR, margfeldi PCR, PCR á staðnum, Öfugt PCR, RT-PCR, qPCR（1）–PCR

Við munum flokka hugtökin, skrefin og smáatriðin í ýmsum PCR

Ⅰ. PCR

Polymerase Chain Reaction, sem vísað er til sem PCR, er sameindalíffræðileg tækni sem er notuð til að stækka ákveðin DNA brot.Það má líta á það sem sérstaka DNA afritun in vitro.DNA pólýmerasi (DNA pólýmerasi I) var uppgötvaður strax árið 1955 og Klenow brot af E. Coli, sem hefur tilraunagildi og hagkvæmni, uppgötvaðist af Dr. H. Klenow snemma á áttunda áratugnum, en vegna þess að þetta ensím þolir ekki hitastig getur hár hiti hrörnað það, svo það mætir ekki háhita hrörnunarkeðjuverkuninni.Ensímin sem eru í notkun í dag (kallað Taq polymerasi) voru einangruð úr Thermus aquaticus, hverabakteríu árið 1976. Einkenni hennar er að það þolir háan hita og er tilvalið ensím, en það er mikið notað eftir 1980.Upprunalega hugmyndin um upprunalegu frumgerðina af PCR er svipuð genaviðgerð og -afritun, sem Dr. KJell Kleppe lagði til árið 1971. Hann gaf út fyrsta einfalda og skammtímagenafritið (svipað og fyrstu tvær lotuviðbrögð PCR).PCR sem þróað var í dag var þróað af Dr. Kary B. Mullis árið 1983. Dr. Mullis þjónaði PE-fyrirtækjum það ár, þannig að PE hefur sérstöðu í PCR-iðnaðinum.Dr. Mullis birti opinberlega fyrstu tengdu ritgerðina með Saiki og fleirum árið 1985. Síðan þá hefur notkun PCR verið þúsundir kílómetra á dag og segja má að gæði tengdra greina geri margar aðrar rannsóknaraðferðir ósmekklegar.Í kjölfarið er PCR tækni mikið notuð í líffræðilegum vísindarannsóknum og klínískum umsóknum, sem verður mikilvægasta tækni sameindalíffræðirannsókna.Mullis hlaut einnig Nóbelsverðlaunin í efnafræði árið 1993.

PCRMeginregla

Grundvallarreglan í PCR tækni er svipuð náttúrulegu afritunarferli DNA og sérhæfni þess fer eftir fákjarna grunninum sem er viðbót við báða enda markraðar.PCR er samsett úr hrörnunar-glæðingu-útvíkkandi þremur grunnviðbragðsþrepum: ①Hörnun sniðmáts-DNA: Eftir að sniðmát-DNA hefur verið hitað í um 93°C í ákveðinn tíma, tvöfalda DNA-lausnin fyrir tvíkeðju-DNA sem myndast við PCR mögnun sniðmáts-DNA sem fer, gerir það að einni keðju með frumhvarfinu til að hægt sé að sameina það fyrir næsta frumhvarf.②Hlæðing (samsetning) sniðmáts-DNA og grunnsins: Eftir að sniðmát-DNA er hitað og hrörnað í eina keðju, lækkar hitastigið í um það bil 55°C.Viðbótarröð primersins og sniðmáts DNA einkeðju.③ Framlenging primersins: DNA sniðmát - primerbindingin er byggð á verkun TaqDNA pólýmerasa, með dNTP sem hvarfhráefni.Haltu meginreglunni um afritun, búðu til nýja hálf-frátekna afritskeðju sem bætir við sniðmát DNA keðjuna, og endurtaktu hringrás hrörnun-glæðing-framlengingu.Það tekur 2-4 mín að klára lykkjuna, markgenið er hægt að magna upp nokkrum milljón sinnum á 2-3 klst.

StandardPCRViðbragðskerfi

Fimm þættir PCR viðbragða

Það eru aðallega fimm tegundir efna sem taka þátt í PCR viðbrögðum, þ.e. grunnur, ensím, dNTP, sniðmát og stuðpúði (Mg2+ er krafist).[PCR aðferð]

Hið staðlaða PCR ferli er skipt í þrjú skref

1. DNA hrörnun (90°C-96°C): Tvíkeðju DNA sniðmát undir hitauppstreymi, vetnistengi brotna og mynda einkeðju DNA.

2. Hreinsun (25℃ -65℃): Kerfishitastigið er lækkað, grunnurinn er sameinaður DNA sniðmátinu til að mynda staðbundna tvíkeðju.

3. Framlenging (70℃ -75℃): Undir verkun Taq ensímsins (um 72°C, besta virknin), er dNTP notað sem hráefni, nær frá 5′ enda grunnsins → 3′ enda, nýmyndun og sniðmát bæta hvert annað DNA keðju.

Hver hringrás er eðlisvötnuð, glærð og framlengd, sem tvöfaldar DNA innihaldið.Sem stendur, vegna stutts mögnunarsvæðis, er hægt að endurtaka hluta PCR á mjög stuttum tíma jafnvel þótt Taq ensímvirknin sé ekki ákjósanleg, þannig að það er hægt að breyta henni í tvö skref, það er að segja að hægt sé að framkvæma glæðingu og framlengingu við 60°C-65°C á sama tíma.Til að draga úr ferli lyftinga og kælingar og bæta viðbragðshraðann.

PCR Reaction eiginleikar

● High-Specificity

Sérstakir afgerandi þættir PCR-svörunar eru: ①Sértæk samsetning primersins og sniðmáts-DNA.②Meginreglan um grunnpörun.③ Tryggð TaqDNA pólýmerasa nýmyndunarviðbragðsins.④Sérhæfni og íhaldssemi markgensins.

Rétt samsetning grunnur og sniðmát er lykillinn.Binding grunnsins og sniðmátsins og framlenging grunnkeðjunnar eru byggð á meginreglunni um basasamsvörun.Tryggð viðbrögð við myndun pólýmerasa og háhitaþol Taq DNA pólýmerasans til að gera bindingu (efnasamband) sniðmátsins og grunnsins í hvarfinu er hægt að framkvæma við hærra hitastig.Sérhæfni samsetningarinnar er mjög aukin.Búturinn getur viðhaldið mikilli nákvæmni.Með því að velja erfðafræðilegt marksvæði með mikla íhaldssemi og mikla íhaldssemi er sérhæfni þess meiri.

● Mikil næmi

Framleiðslumagn PCR vara er aukið með vísitölu, sem getur stækkað upphafssniðmát Picker (PG=10-12) til að auka magn örstýringar upp í míkrógrömm (μg= -6).Hægt er að greina markfrumur úr 1 milljón frumum;við uppgötvun vírusa getur næmi PCR náð 3 RFU (tómir blettir myndast einingar);lágmarksgreiningarhlutfall í bakteríufræði er 3 bakteríur.

● Einfalt og hratt

PCR spegilmyndin notar háhita Taq DNA pólýmerasa, sem bætir við hvarflausninni í einu, það er hrörnunar-glæðing-framlengingarviðbrögð á DNA mögnunarlausninni og vatnsbaðpottinum.Almennt er mögnunarhvarfinu lokið á 2 til 4 klukkustundum.Auknar vörur eru almennt greindar með rafmagnssverði og þurfa ekki að nota samsætur, engin geislavirk mengun og auðveld kynning.

● Hreinleiki sýnisins er lítill

Það er engin þörf á að aðskilja vírusa eða bakteríur og ræktunarfrumur.Hægt er að nota hráefni DNA og RNA sem magnara.Hægt er að nota DNA mögnunargreiningu beint með því að nota klínísk sýni eins og blóð, líkamsvökva, hóstaþvottavökva, hár, frumur og lifandi vefi.

PCRalgeng vandamál

● Falsk neikvæð, engin magnaðar bönd

Lykilstig PCR hvarfsins eru: ① undirbúningur á sniðmátkjarnsýrum, ② gæði og sérhæfni frumra, ③ gæði ensíma ④ PCR hringrásarskilyrði.Að finna ástæðuna ætti einnig að greina og rannsaka fyrir ofangreinda tengla.

Sniðmát: ① Sniðmátið inniheldur ýmis prótein, ② Sniðmátið inniheldur Taq ensímhemla, ③ Próteinið í sniðmátinu er ekki eytt, sérstaklega hóppróteinið í litningnum.⑤ Deminer kjarnsýru hrörnun er ekki ítarleg.Þegar gæði ensíma og primers eru góð er ekkert mögnunarband, sem er líklegast meltingarmeðferð sýna.Það er eitthvað athugavert við sniðmátkjarnsýruútdráttarferlið, svo til að búa til árangursríka og stöðuga meltingarlausn ætti að laga aðferðina og ekki breyta geðþótta.

Ensímóvirkjun: Nýtt ensím eða bæði gamalt og nýtt ensím ætti að nota saman til að greina hvort ensímvirkni glatist eða sé ófullnægjandi, sem leiðir til falskra neikvæðra áhrifa.Það skal tekið fram að Taq ensím eða etídíumbrómíð gleymist stundum.

Grunnur: gæði grunnsins, styrkur grunnsins og hvort styrkur grunnsins tveggja sé samhverfur.Það er algeng ástæða fyrir PCR-biluninni eða að stækkandi bandið er ekki tilvalið og viðkvæmt fyrir dreifingu.Vandamál eru með gæði grunna sumra lotunúmera.Primerarnir tveir hafa háan styrk og lágan styrk, sem veldur ósamhverfri mögnun með lítilli skilvirkni.Mótráðstafanirnar eru: ① Veldu góðan grunn til að búa til einingar.② Styrkur grunnsins fer ekki aðeins eftir OD-gildinu heldur tekur einnig eftir upprunalega vökvanum grunnsins til að gera agar sykurhlaup rafdrætti.Það verður að vera grunnstripsvæði og birta beggja grunnanna ætti að vera almennt í samræmi.Belti, PCR gæti bilað á þessum tíma og það ætti að leysa það með grunngerðareiningunni.Ef grunnur er hár er birtan lág og styrkur hans verður að vera í jafnvægi þegar hann er þynntur.③ Grunnurinn ætti að borga og geyma í háum styrk til að koma í veg fyrir marga frystingu eða langtíma kælihluti kæliskápsins, sem mun valda því að grunnurinn skemmist og brotnar niður.④ Hönnun grunnsins er ósanngjarn, svo sem að lengd grunnsins er ófullnægjandi og tvíþyrpingin myndast á milli grunnanna.

Mg2+styrkur: Mg2+jónastyrkur hefur mikil áhrif á PCR mögnunarvirkni.Of mikill styrkur getur dregið úr gagnstæðu kyni PCR mögnunar.Ef styrkurinn er of lágur mun PCR mögnunarúttakið jafnvel gera PCR mögnunarbilunina án stækkunarbandsins.

Breyting á hvarfmagni: Rúmmálið sem notað er í PCR mögnun er 20ul, 30ul og 50ul eða 100uL, stórt rúmmál umsóknar um PCR mögnun er stillt í samræmi við mismunandi tilgang vísindarannsókna og klínískra prófana.Eftir að hafa búið til lítið magn eins og 20ul, er nauðsynlegt að gera snúruskilyrði þegar stærðin er gerð, annars mun hún mistakast.

Líkamlegar ástæður: Umbreyting er mjög mikilvæg fyrir PCR mögnun.Ef hrörnunarhitastigið er lágt, er hrörnunartíminn stuttur, líklegt er að það komi fram í fölskum neikvæðum;of lágt glæðingarhitastig getur valdið ósértækri mögnun og dregið úr sértækri mögnunarvirkni.Hafa mikil áhrif á samsetningu primers og sniðmáta til að draga úr PCR mögnunarvirkni.Stundum er nauðsynlegt að nota staðlaða hitamæla til að greina breytileika, glæðingu og langan hita í framlengingunni eða vatnsleysanlegu eldavélinni, sem er ein af ástæðunum fyrir bilun í PCR.

Afbrigði markraðar: Ef markröðin á sér stað, stökkbreyting eða brottfelling, sameining frumgerðarinnar og sniðmátsins er sameinuð, eða vegna skorts á markröð, missa primerinn og sniðmátið sambótaröðina og PCR mögnun hennar mun ekki skila árangri.

● Falskt jákvætt

PCR mögnunarbandið virðist vera í samræmi við markraðarbandið og stundum er band þess snyrtilegra og hærra.

Grunnhönnun á ekki við: valin mögnunarröð og mögnunarröð án tilgangs eru samhljóða, þannig að við PCR mögnun eru mögnuðu PCR afurðirnar ómarkvissar raðir.Markröðin er of stutt eða primerinn er of stuttur og honum er hætt við að vera rangt jákvætt.Þarf að endurhanna.

Krossmengun markraðar eða mögnunarafurða: Það eru tvær ástæður fyrir þessari mengun: Í fyrsta lagi víxlmengun alls genamengsins eða stórra hluta, sem leiðir til falskra jákvæða.Þessa tegund af fölskum jákvæðum er hægt að leysa með eftirfarandi aðferðum: Vertu varkár og varkár meðan á notkun stendur til að koma í veg fyrir að markröðin andist inn í sýnisbyssuna eða skvettist út úr miðflóttarörinu.Fyrir utan ensím og efni sem þola ekki háan hita, skal sótthreinsa öll hvarfefni eða búnað með háum þrýstingi.Nota skal miðflótta rör og sýni í einu.Þegar nauðsyn krefur, áður en sýnum er bætt við, eru hvarfglasið og hvarfefnið útsett fyrir útfjólubláum geislum til að eyðileggja núverandi kjarnsýru.Í öðru lagi, lítil brot í loftmenguninni.Þessir litlu brot eru styttri en markröðin, en þau hafa ákveðna samlíkingu.Það er hægt að splæsa við hvert annað.Eftir að primerarnir hafa verið bættir við er hægt að stækka PCR vöruna, sem mun valda falska jákvæðri framleiðslu.Það er hægt að nota til að draga úr eða útrýma nest PCR aðferðinni.

● Birtist ósértæk mögnunarband

Böndin sem komu fram eftir PCR mögnun eru ekki í samræmi við væntanleg stærð, eða stór eða lítil, eða á sama tíma, eða á sama tíma, sérstök mögnunarbönd og ósértæk mögnunarbönd.Tilkoma ósértækra bönda er: Í fyrsta lagi eru primers ófullnægjandi viðbót við markröðina, eða fjölliðun primersins til að mynda tvíþyrping.Annað er að styrkur MG2+jóna er of hár, glæðingarhitastigið er of lágt og fjöldi PCR lota er tengdur.Í öðru lagi, gæði og magn ensíma.Oft eru ensím úr sumum uppsprettum hætt við ósérstökum böndum og ensím hinnar uppsprettunnar koma ekki fram.Stundum á sér einnig stað ósértæk mögnun ensíma.Mótvægisaðgerðirnar eru: endurhönnuð aðlaðandi ef þörf krefur.Dragðu úr magni ensíms eða skiptu um ensím frá öðrum uppruna.Minnkaðu magn aðal, aukið magn sniðmáta á viðeigandi hátt og fækkaðu lotum.Hækkaðu útglöðuhitastigið á réttan hátt eða notaðu tveggja hitastigsaðferðina (93°C hrörnun, glæðing og framlenging við um 65°C).

● Sýnast flagnandi dráttur eða strokband

PCR mögnun virðist stundum vera beitt eða skellt eða teppalíkt belti.Af þeirri ástæðu, vegna of mikið magn af ensímum eða lélegra gæða ensímsins, er dNTP styrkurinn of hár, Mg2+ styrkurinn er of hár, hitastigið við hitastigið er of lágt og fjöldi lota er of mikill.Mótráðstafanirnar eru: ① Dragðu úr magni ensíma, eða breyttu ensími frá öðrum uppruna.② Dragðu úr styrk dNTP ③ Dragðu úr styrk Mg2+ á réttan hátt.④ Auktu magn sniðmáta og minnkaðu fjölda lota.

skyldar vörur

PCR Heroᵀᴹ (Með Dye)

◮ Meiri tryggð: 6 sinnum meiri en venjulegt Taq ensím;

◮ Hraðari mögnunarhraði

◮ Meiri aðlögunarhæfni sniðmáta

◮ Meiri mögnunarvirkni

◮ Umhverfisþol er sterkara: sett við 37°C í viku, viðheldur meira en 90% virkni;

◮ Það hefur 5'→3' DNA pólýmerasa virkni og 5'→3' exonucleasa virkni, án 3'→5' exonucleasa virkni.

PCR Easyᵀᴹ (með litarefni)

Einstakt hvarfkerfi og hávirkni Taq DNA pólýmerasa gera PCR viðbrögðin með meiri mögnunarvirkni, sérhæfni og næmi.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Eitt skref)-SYBR Grænt I

◮ Eins þrepa sett gerir öfuga umritun og qPCR tvö viðbrögð í sömu túpunni, þarf aðeins að bæta við sniðmáti RNA, sérstökum PCR primers og RNase-Free ddH₂O.

◮ Settið getur á fljótlegan og skilvirkan hátt greint veiru-RNA eða snefil-RNA.

◮ Settið notar einstakt Foregene öfugt umritunarefni og Foregene HotStar Taq DNA pólýmerasa ásamt einstöku hvarfkerfi til að bæta mögnunarvirkni og sérhæfni hvarfsins á áhrifaríkan hátt.

◮ Bjartsýni hvarfkerfisins gerir það að verkum að hvarfið hefur hærra greiningarnæmi, sterkari hitastöðugleika og betra þol.

◮ RT-qPCR Auðvelt^TM(Eitt skref)-SYBR Grænt I settið kemur með ROX innri viðmiðunarlitarefni, sem hægt er að nota til að útrýma merkjabakgrunni og merkjavillum milli brunna, sem er þægilegt fyrir viðskiptavini að nota í mismunandi gerðum af magnbundnum PCR tækjum.

RT Auðvelt^TMII (Master Premix fyrir cDNA nýmyndun fyrsta strengs fyrirrauntíma PCR)

-Árangursrík hæfni til að fjarlægja gDNA, sem getur fjarlægt gDNA í sniðmátinu innan 2 mínútna.

- Skilvirkt öfugt umritunarkerfi, það tekur aðeins 15 mínútur að klára myndun fyrsta strengs cDNA.

-Flókin sniðmát: sniðmát með hátt GC innihald og flókna aukabyggingu er einnig hægt að snúa við með mikilli skilvirkni.

-Hátt næmt öfugt umritunarkerfi, pg-stigi sniðmát geta einnig fengið hágæða cDNA.

- Öfug umritunarkerfið hefur mikinn hitastöðugleika, ákjósanlegur hvarfhiti er 42 ℃ og það hefur enn góða öfuga umritunarafköst við 50 ℃.