Upphafsefni: RNA
Magnbundin öfug umritun PCR (RT-qPCR) er tilraunaaðferð sem notuð er í PCR tilraunum með RNA sem upphafsefni.Í þessari aðferð er heildar-RNA eða boðbera-RNA (mRNA) fyrst umritað í complementary DNA (cDNA) með öfugum transkriptasa.Í kjölfarið var qPCR viðbrögð framkvæmd með því að nota cDNA sem sniðmát.RT-qPCR hefur verið notað í margvíslegum sameindalíffræðilegum forritum, þar á meðal genatjáningargreiningu, RNA truflun sannprófun, örfylkingarfullgildingu, sjúkdómsgreiningu, erfðaprófum og sjúkdómsrannsóknum.
Eins þrepa og tveggja þrepa aðferðir fyrir RT-qPCR
RT-qPCR er hægt að ná með eins-þrepa eða tveggja þrepa aðferð.Einþreps RT-qPCR sameinar öfuga umritun og PCR mögnun, sem gerir öfugriti og DNA pólýmerasa kleift að ljúka efnahvarfinu í sömu túpunni við sömu biðminni.Eins-þreps RT-qPCR krefst aðeins notkunar á raðsértækum frumum.Í tveggja þrepa RT-qPCR er öfug umritun og PCR mögnun framkvæmd í tveimur túpum, með mismunandi bjartsýni stuðpúða, hvarfaðstæður og grunnhönnunaraðferðir.
| Kostur | Ókostur | |
| Eitt skref | Þessi aðferð hefur minni tilraunavillur þar sem bæði viðbrögðin eru gerð í einu röri
Færri pípulagningarskref draga úr hættu á mengun
Hentar fyrir mögnun/skimun með miklum afköstum, hratt og hægt að endurskapa | Ekki er hægt að fínstilla tveggja þrepa viðbrögð sérstaklega
Þar sem hvarfskilyrðin eru í hættu með því að sameina tveggja þrepa viðbrögðin, er næmið ekki eins gott og tveggja þrepa aðferðarinnar
Fjöldi skotmarka sem greindust í einu sýni er lítill |
| Tvö skref | Geta til að búa til stöðug cDNA söfn sem hægt er að geyma í langan tíma og nota í mörgum viðbrögðum
Hægt er að magna markgen og viðmiðunargen úr sama cDNA safni án þess að þurfa mörg cDNA söfn
Hvarfstuðpúðar og hvarfskilyrði sem gera kleift að hagræða stakar hvarfkeyrslur
Sveigjanlegt val á kveikjuskilyrðum | Notkun margra röra og fleiri píptuþrep eykur hættuna á DNA mengun, og tímafrekt.
Krefst meiri hagræðingar en eins þrepa aðferðin |
Skyldar vörur:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Eitt skref)-SYBR Grænt I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Eitt skref)-Taqman
RT Easyᵀᴹ I Master Premix fyrir fyrsta flokks CDNA myndun
Rauntíma PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Val á heildar-RNA og mRNA
Við hönnun á RT-qPCR tilraun er mikilvægt að ákveða hvort nota eigi heildar-RNA eða hreinsað mRNA sem sniðmát fyrir öfuga umritun.Þrátt fyrir að mRNA geti veitt aðeins hærra næmi, er heildar-RNA samt oft notað.Ástæðan fyrir þessu er sú að heildar-RNA hefur mikilvægari forskot sem upphafsefni en mRNA.Í fyrsta lagi krefst ferlið færri hreinsunarþrep, sem tryggir betri magnbundinn endurheimt sniðmáts og betri staðla niðurstöður í upphafsfrumunúmer.Í öðru lagi forðast það mRNA auðgunarskrefið, sem getur forðast möguleika á skekktum niðurstöðum vegna mismunandi endurheimta mismunandi mRNA.Á heildina litið, þar sem hlutfallsleg magngreining markgensins er mikilvægari en algert næmi uppgötvunarinnar í flestum forritum, hentar heildar-RNA betur í flestum tilfellum.
Reverse transscription primer
Í tveggja þrepa aðferðinni er hægt að nota þrjár mismunandi aðferðir til að ræsa cDNA hvarfið: oligo(dT) primers, random primers eða raðsértæka primers.Venjulega eru oligo(dT) primers og random primers notaðir saman.Þessir primerar bindast við sniðmát mRNA strenginn og veita öfugum transkriptasa með upphafspunkti fyrir myndun.
| Grunnur val | Uppbygging og virkni | Kostur | Ókostur |
| Oligo(dT) grunnur (eða festur oligo(dT) grunnur) | Lengri tenging við týmínleifar við poly(A) hala mRNA;anchor oligo(dT) primer inniheldur G, C eða A í 3′ endanum (anchor site) | Nýmyndun cDNA í fullri lengd úr fjöl(A)-hala mRNA
Gildir þegar minna upphafsefni er til
Festingarstaður tryggir að oligo(dT) grunnurinn binst 5′ poly(A) hala mRNA | Hentar aðeins til að magna gena með poly(A) hala
Fáðu cDNA stytt frá frumunarstað*2 í poly(A)
Hlutdrægt til að bindast við 3′ enda*
*Þessi möguleiki er lágmarkaður ef festir oligo(dT) primers eru notaðir |
| tilviljunarkenndur grunnur
| 6 til 9 basar að lengd, sem getur tengst mörgum stöðum meðan á RNA umritun stendur | Gleypa öll RNA (tRNA, rRNA og mRNA)
Hentar fyrir afrit með verulegri aukabyggingu, eða þegar minna upphafsefni er til
Há cDNA afrakstur | cDNA er öfugt umritað frá öllu RNA, sem venjulega er ekki óskað og getur þynnt merki mark-mRNA
fá stytt cDNA |
| raðsértæka primers | Sérsniðnir grunnar sem miða á sérstakar mRNA raðir | sérstakt cDNA safn
Bættu viðkvæmni
Notkun öfugra qPCR grunna | Aðeins takmarkað við myndun eins markgena |
Reverse transcriptasi
Reverse transcriptasi er ensím sem notar RNA til að búa til DNA.Sumir bakritar hafa RNase virkni og geta brotið niður RNA þræði í RNA-DNA blendingsþráðum eftir umritun.Ef það hefur ekki RNase ensímvirkni er hægt að bæta RNaseH við til að fá meiri qPCR skilvirkni.Algengt notuð ensím eru meðal annars Moloney músahvítblæðisveiru bakrita og fugla mergæxla veiru bakrita.Fyrir RT-qPCR er tilvalið að velja bakrit með meiri hitastöðugleika, þannig að hægt sé að framkvæma cDNA nýmyndun við hærra hitastig, sem tryggir árangursríka umritun RNA með hærri efri uppbyggingu, en viðhalda fullri virkni þeirra í gegnum hvarfið, sem leiðir til hærri cDNA afraksturs.
Skyldar vörur:
Foreasy M-MLV Reverse Transcriptase
RNase H virkni bakrita
RNaseH er fær um að brjóta niður RNA þræði úr RNA-DNA tvíþáttum, sem gerir skilvirka myndun tvíþátta DNA kleift.Hins vegar, þegar langt mRNA er notað sem sniðmát, getur RNA brotnað of snemma, sem leiðir til stytts cDNA.Þess vegna er oft gagnlegt að lágmarka RNaseH virkni meðan á cDNA klónun stendur ef óskað er eftir nýmyndun á löngum umritum.Aftur á móti eru öfugumritanir með RNase H virkni oft gagnlegar fyrir qPCR notkun vegna þess að þeir auka bráðnun RNA-DNA tvíhliða í fyrstu lotu PCR.
Grunnhönnun
PCR primers sem notaðir eru fyrir qPCR skrefið í RT-qPCR ættu helst að vera hannaðir til að spanna exon-exon tengi, þar sem mögnunargrunnur gæti hugsanlega spannað raunveruleg exon-intron mörk.Þar sem intron-innihaldandi erfðafræðileg DNA raðir eru ekki magnaðar, dregur þessi hönnun úr hættu á fölskum jákvæðum mögnuðum frá mengandi erfðafræðilegum DNA.
Ef ekki er hægt að hanna primera til að aðskilja exon eða exon-exon mörk, getur verið nauðsynlegt að meðhöndla RNA sýni með RNase-fríu DNase I eða dsDNase til að fjarlægja erfðafræðilega DNA mengun.
RT-qPCR stjórn
Neikvætt umritunareftirlit (-RT stjórn) ætti að vera með í öllum RT-qPCR tilraunum til að greina DNA mengun (eins og erfðafræðilegt DNA eða PCR afurðir frá fyrri viðbrögðum).Þessi stýring inniheldur alla hvarfþætti nema bakrita.Þar sem öfug umritun á sér ekki stað með þessari stjórn, ef PCR mögnun sést, er mengun frá DNA líklegast.
Pósttími: ágúst-02-2022
